发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡营养物质表观消化率、血清生化指标、肠道形态及盲肠微生物菌群的影响

王天丽 梁丽芬 宾石玉 何流琴 姚 婷 王晨昱 李铁军*

(1.中国科学院亚热带农业生态研究所,中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室,长沙 410125;2.中国科学院大学现代农业科学学院,北京 100049;3.广西师范大学生命科学学院,珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室,桂林 541006;4.湖南师范大学生命科学学院,动物肠道功能调控湖南省重点实验室,长沙 410081)

肉鸡产业是我国畜禽养殖中集约化程度较高的产业,其快速发展促使饲料需求量剧增,进而导致蛋白质饲料供给短缺问题日趋突出。糟渣,即农副产品加工的废弃物,具有含水量高、易黏结成团、物理形状差异大、pH差异大、含有抗营养因子等特点[1];而经微生物发酵处理后的糟渣,其适口性得到改善,营养水平和营养价值也得到提高[2]。研究发现,将发酵后的糟渣应用于动物饲粮中,具有提高生长性能、改善肠道环境、提高消化吸收能力和免疫力、降低饲料成本及改善畜产品品质等功能作用[3-4]。罗汉果(Siraitiagrosvenorii)是一种葫芦科植物,主要种植于广西、广东、贵州等地,其中,广西的罗汉果产量占全球的90%以上[5]。罗汉果经提取利用后剩余大量果渣,有文献报道[6],每个罗汉果的浸泡物的干重为2 g,但只能提取利用35%,而剩下的65%罗汉果渣只能当作农业废弃物处理,造成大量浪费。罗汉果渣的粗蛋白质(CP)含量与玉米秸秆相当,但其粗纤维(CF)含量较高,不利于动物的消化吸收,而使用微生物菌剂进行发酵,对其青贮品质和营养成分保留有一定的改善作用[7]。罗汉果苷是罗汉果的主要甜味成分,该物质可能通过影响瘤胃微生物数量以及消化酶活性,从而提高饲料利用率,促进动物生长[8]。此外,罗汉果苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌等有抑菌作用,它还可以调节肠道微生物菌群组成和短链脂肪酸合成[9]。目前,针对发酵罗汉果渣的营养价值及其在畜禽饲粮中的应用研究较少。因此,本研究通过代谢试验,探讨发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡营养物质表观消化率、血清生化指标、肠道形态及盲肠微生物菌群的影响,为罗汉果渣发酵饲料在黄羽肉鸡生产中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵罗汉果渣来源于桂林某生物科技有限公司。发酵底物分别为100%罗汉果渣原料和80%罗汉果渣原料+20%麸皮;所使用的酶制剂包含木聚糖酶、葡聚糖酶、酸性蛋白酶及碱性蛋白酶,菌种包含酵母菌、芽孢杆菌及乳酸菌。将各菌种、酶制剂与发酵底物混匀,30 ℃条件下发酵3 d。

1.2 试验设计和饲养管理

选取15只90日龄中速型成年黄羽肉鸡(公鸡),按组间体重[(2.74±0.32) kg]一致原则分为3组,每组5个重复,每个重复1只鸡。预试期3 d后,将所有试验鸡禁食48 h,采用强饲法进行代谢试验,各组分别强饲罗汉果渣原料(Ⅰ组)、100%发酵罗汉果渣(Ⅱ组)和80%发酵罗汉果渣(Ⅲ组),每只试验鸡强饲50 g,并添加0.4%二氧化钛(TiO2)。罗汉果渣发酵前后的营养水平见表1。

试验鸡单笼单只饲养于代谢笼中,自由饮水,并通过粪盘收集其48 h排泄物。清理粪便,将所得净粪样称重后与10%盐酸混匀,烘干,再称重,接着粉碎、过筛,装袋保存备用。试验在湖南省益阳市沅江市中国农业科学院麻类研究所石矶湖试验鸡舍内进行。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 常规营养水平及营养物质表观消化率

取适量各组饲粮和粪样,参照张丽英[10]的方法分别测定饲粮和粪样中的干物质(DM)、CP、CF、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)、TiO2含量及总能(GE),并计算营养物质表观消化率,计算公式如下:

营养物质表观消化率(%)=1-[(X1/X2)×
(Y2/Y1)]×100。

式中:X1为饲粮中TiO2含量(%);X2为粪便中TiO2含量(%);Y1为饲粮中该营养物质含量;Y2为粪便中该营养物质含量(%)。

1.3.2 血清生化指标

代谢试验结束后,采集试验鸡血液样本,收集到真空血管中。常温静置约45 min后,在4 ℃条件下以3 000 r/min离心10 min,随后将血清于-20 ℃中保存。采用全自动生化分析仪(Cobas C311,瑞士)和试剂盒(北京利德曼生物技术有限公司)测定血清生化指标。所测定的指标包括:总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、尿素氮(urea nitrogen,UN)、葡萄糖(glucose,GLU)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)含量及谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性。

1.3.3 肠道形态

采血结束后,将试验鸡致死,迅速剖开腹腔,分离出十二指肠、空肠和回肠,各肠段取1 cm组织样,经10%甲醛溶液快速固定。肠段样品固定后,经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色,制成切片。在40倍显微镜下观察,测量肠道的绒毛高度(villous height,VH)和隐窝深度(crypt depth,CD),并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)。

1.3.4 盲肠微生物菌群

收集试验鸡盲肠内容物,用于16S rRNA测序。使用试剂盒提取盲肠内容物总DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度及纯度。选择16S rRNA基因V3～V4区特异性引物对盲肠内容物进行PCR扩增,并纯化其产物。建立一个测序文库并对其进行质检,通过Illumina NovaSeq 6000对质检合格的文库测序得到原始数据,再经碱基识别分析后转化为原始测序序列。对原始测序序列进行质量过滤、双端序列拼接和去除嵌合体后,得到有效数据。最后基于有效数据,综合运用多种数据分析方法(如物种分类学分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析等)对各组试验鸡的肠道微生物菌群进行分析。

1.4 数据统计分析

试验数据经Excel 2021进行初步处理后,采用SPSS 26.0软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)方法进行分析,并采用Duncan氏法进行多重比较。结果以平均值±标准差表示,P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡营养物质表观消化率的影响

由表2可知,与Ⅰ组相比,Ⅱ组和Ⅲ组的DM、CP、Ash、EE和GE表观消化率均显著提高(P<0.05),CF表观消化率无显著差异(P>0.05);Ⅲ组的EE表观消化率显著高于Ⅱ组(P<0.05)。其中,Ⅲ组的DM、CP、Ash、EE、CF和GE表观消化率均最高。

2.2 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡血清生化指标的影响

由表3可知,各组之间血清生化指标无显著差异(P>0.05)。

表3 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡营养物质表观消化率的影响

表3 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡血清生化指标的影响

2.3 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡肠道形态的影响

黄羽肉鸡的十二指肠、空肠和回肠肠道形态见图1。由表4可知,在十二指肠中,与Ⅰ组相比,Ⅱ组的VH和V/C显著降低(P<0.05),CD显著升高(P<0.05);Ⅲ组的VH和V/C显著升高(P<0.05),CD无显著差异(P>0.05)。在空肠中,与Ⅰ组相比,Ⅱ组的VH和V/C显著升高(P<0.05),CD无显著差异(P>0.05);Ⅲ组的VH和CD显著升高(P<0.05),V/C无显著差异(P>0.05)。在回肠中,与Ⅰ组相比,Ⅱ组和Ⅲ组的VH均显著升高(P<0.05),CD和V/C无显著差异(P>0.05)。

表4 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡不同肠段肠道形态结构的影响

Ⅰ:Ⅰ组 group Ⅰ;Ⅱ:Ⅱ组 group Ⅱ; Ⅲ:Ⅲ组 group Ⅲ。下图同 the same as below.

2.4 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡盲肠微生物菌群的影响

根据营养物质表观消化率、血清生化指标以及肠道形态结果,判断出80%发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡的影响较大,因此选用Ⅰ组和Ⅲ组进行盲肠微生物菌群分析。

2.4.1 盲肠微生物多样性分析

由图2-A可知,随着样品序列数的增加,稀释性曲线逐渐趋于平缓,表明测序数据量充足。对黄羽肉鸡盲肠微生物进行Alpha多样性分析,由图2-B可知,与Ⅰ组相比,Ⅲ组的Shannon指数和Simpson指数均显著降低(P<0.05),而ACE指数和Chao1指数无显著差异(P>0.05)。Beta多样性分析能够比较不同样品的微生物菌群构成差异,在主坐标分析(PCoA)中,距离越近的样品,微生物菌群构成越相似。由图2-C可知,主成分1和主成分2的贡献值分别为26.42%和22.77%,且Ⅰ组与Ⅲ组的微生物菌群分布相对零散,微生物菌群构成差异明显。

2.4.2 盲肠微生物组成、差异分析及功能预测

由图3-A可知,在门水平上,对盲肠微生物相对丰度排行前10的菌群进行统计发现,拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)相对丰度总和达85%以上。与Ⅰ组相比,Ⅲ组的拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度分别提高了3.56%和21.87%。

由图3-B可知,在属水平上,相对丰度排列前10的菌属分别是拟杆菌属(Bacteroides)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、丹毒丝菌科UCG-004(Erysipelotrichaceae_UCG-004)、uncultured_bacterium_o_Bacteroidales、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae、uncultured_bacterium_f_Prevotellaceae、互养菌属(Synergistes)和Candidatus_Vestibaculum。与Ⅰ组相比,Ⅲ组的丹毒丝菌科UCG-004相对丰度显著提高(P<0.05),uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae相对丰度显著降低(P<0.05)。

利用线性判别分析效应量(LEfSe)分析比较Ⅰ组和Ⅲ组之间相对丰度具有显著差异的微生物,由图4可知,特异性微生物菌群共有19个。其中,在Ⅰ组中显著富集的有12个,包括梭菌目(Clostridiales)、梭菌纲(Clostridia)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)等;在Ⅲ组中显著富集的有7个,包括丹毒丝菌科UCG-004、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)等。

对盲肠微生物菌群第3层级的KEGG功能差异预测,由图5可知,与Ⅰ组相比,Ⅲ组的嘧啶代谢、嘌呤代谢、糖酵解/糖异生和氨基糖及核苷酸糖代谢通路丰度显著升高(P<0.05)。

A:稀释性曲线;B:Alpha多样性分析;C:主坐标分析。

图5 盲肠微生物菌群第3层级的KEGG功能差异预测

2.4.3 盲肠微生物相对丰度与营养物质表观消化率相关性分析

将相对丰度前10的差异菌属与营养物质表观消化率进行相关性分析,由图6可知,uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae相对丰度与CF、Ash、GE、DM和CP表观消化率存在显著的负相关(P<0.05),栖粪杆菌属相对丰度与GE表观消化率存在显著的负相关(P<0.05),丹毒丝菌科UCG-004相对丰度与GE和DM表观消化率存在显著的正相关(P<0.05)。

图6 盲肠微生物相对丰度与营养物质表观消化率相关性分析

3 讨 论

3.1 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡营养物质表观消化率的影响

营养物质表观消化率是评估肉鸡对饲粮中营养物质消化吸收能力的重要指标[11]。有文献报道,发酵后的饲料可以改善家禽的营养物质表观消化率[12]。研究发现,在饲粮中添加2.5%发酵豆粕可提高蛋雏鸡CP和Ash表观消化率[13],发酵葡萄籽粕能显著提高五龙鹅对CP、CF和EE的利用率[14]。与上述结果相似,本试验结果显示,发酵后的罗汉果渣均能提高黄羽肉鸡的CP、DM、Ash、EE及GE表观消化率,并且80%发酵罗汉果渣的6种营养物质表观消化率都是最高的。较高CF含量的饲粮会降低营养物质表观消化率[15]。在本试验中,发酵后的罗汉果渣均能提高营养物质表观消化率,这可能与发酵后的罗汉果渣CF含量降低有关。

3.2 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡血清生化指标的影响

血清生化指标是反映机体综合代谢能力与健康状况的重要指标。血清中TP含量可反映机体吸收饲料中蛋白质的情况及体液免疫情况,AST、ALT活性和UN含量可反映机体肾功能代谢情况,TG、TC、LDL-C和HDL-C含量可反映机体脂质代谢情况[16]。本试验结果显示,发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡血清生化指标无显著影响,表明发酵罗汉果渣短期内不会对黄羽肉鸡综合代谢能力产生不利影响。

3.3 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡肠道形态的影响

VH、CD及V/C是评估动物肠道健康状况的关键指标[17]。VH反映了小肠与营养物质的接触面积,小肠VH越高,则肠黏膜表面积越大,营养物质与肠道接触越充分,越有利于营养物质的吸收利用[18];CD反映了细胞生成率,若CD变浅,则说明肠上皮细胞成熟率上升,吸收功能增强[19]。故一般情况下,VH增大,CD减小,V/C增大,消化吸收功能则增强。王国军等[20]研究发现,饲粮中添加6%的益生菌发酵苹果渣能够显著提高断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠的VH以及十二指肠和空肠的V/C,显著降低十二指肠和空肠的CD。在本试验中,与罗汉果渣原料相比,100%发酵罗汉果渣显著降低了十二指肠的VH和V/C,显著升高了十二指肠的CD、回肠的VH以及空肠的VH、V/C;80%发酵罗汉果渣显著升高了十二指肠、空肠和回肠的VH以及十二指肠的V/C,与前人研究结果相似。本试验时间较短,故结合前人研究结果可推断出,发酵后的罗汉果渣在短期内可改善肉鸡的肠道形态结构,增强肠道消化吸收功能。这可能与罗汉果渣中的主要有效成分——罗汉果皂苷有关,罗汉果皂苷具有抗炎抗氧化作用和免疫作用[21]。

3.4 发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡盲肠微生物菌群的影响

肠道微生物菌群是胃肠道重要的一部分,在维持肠道形态、营养吸收和多种生理活动中发挥了重要作用[22]。Ace指数、Shannon指数、Chao1指数和Simpson指数是判定微生物菌群多样性的重要指标,Ace指数、Shannon指数、Chao1指数越大,Simpson指数越小,说明微生物物种越丰富[23]。本试验中,Ⅲ组的Shannon指数和Simpson指数显著降低,说明发酵罗汉果渣可改变菌群多样性,影响盲肠微生物区系,而根据PCoA结果,80%发酵罗汉果渣可使黄羽肉鸡微生物菌群结构发生显著差变化。其原因可能是,发酵菌剂中的有益菌和发酵罗汉果渣中的抗菌活性成分抑制了肠道中有害菌,从而改变了微生物区系。对于2组间盲肠微生物组成的研究结果表明,厚壁菌门和拟杆菌门是肉鸡肠道中的优势菌门,这与其他学者的研究结果[24-25]一致。厚壁菌门多为纤维分解菌,本试验结果显示80%发酵罗汉果渣使黄羽肉鸡盲肠厚壁菌门相对丰度升高,这可能是发酵后的罗汉果渣CF含量降低,继而引起营养物质表观消化率升高的原因;拟杆菌门直接参与肠道内能量物质(如糖类和脂类)的分解代谢[26],由此猜测80%发酵罗汉果渣使黄羽肉鸡盲肠拟杆菌门相对丰度上升的原因之一,可能是发酵后的罗汉果渣能够增强肉鸡糖代谢。

本试验中,在属水平上,80%发酵罗汉果渣使丹毒丝菌科UCG-004相对丰度显著升高,uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae相对丰度显著降低;LEfSe分析结果也显示,80%发酵罗汉果渣组中黄羽肉鸡盲肠微生物的特异性微生物菌群主要为丹毒丝菌科、丹毒丝菌纲。有证据表明,丹毒丝菌科与宿主脂质代谢之间存在关联[27],低脂饮食组和高脂饮食组的母鸡肠道丹毒丝菌科相对丰度较高[28],饮食诱导肥胖的小鼠肠道丹毒丝菌科相对丰度增加[29]。而80%发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡脂质代谢的影响还有待进一步验证。对盲肠微生物菌群KEGG功能差异预测分析结果显示,80%发酵罗汉果渣通过改变微生物区系对黄羽肉鸡嘧啶代谢、嘌呤代谢、糖酵解/糖异生和氨基糖及核苷酸糖代谢产生显著影响,其原因除了前面提及的,还可能是盲肠微生物中厚壁菌门相对丰度增加;有文献报道,厚壁菌门可以促进肠道中对糖分子的利用,从而带动肠道内物质交换[30]。最后对盲肠微生物相对丰度与营养物质表观消化率进行关联分析发现,uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae相对丰度与CF、Ash、GE、DM、CP表观消化率均呈负相关,丹毒丝菌科UCG-004相对丰度与GE和DM相对丰度消化率呈正相关,这也解释了饲喂发酵罗汉果渣后肉鸡盲肠微生物属水平上,uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和丹毒丝菌科UCG-004相对丰度变化与营养物质表观消化率变化的关系。由于试验期较短,故以上影响均为短期内的,长期饲喂发酵罗汉果渣对黄羽肉鸡肠道微生物菌群的影响还有待进一步研究。

4 结 论

与罗汉果渣原料和100%罗汉果渣原料直接发酵相比,按80%罗汉果渣原料+20%麸皮混合发酵在短期内可有效提高黄羽肉鸡的营养物质表观消化率,改善肠道形态结构,调节盲肠微生物菌群,改变菌群功能代谢通路。