博落回散对番鸭生长性能、肉品质、抗氧化能力及免疫性能的影响

罗鑫宇 葛超悦,2 吕雨杰,2 吴潋池 胡兆莹 郭燕姗,2 曹久爱 刘 兵* 余东游,2*

(1.浙江大学动物科学学院,杭州 310058;2.浙江大学海南研究院,三亚 572025)

博落回属于罂粟科博落回属,在我国分布广泛,主要集中在长江中下游地区。早在《本草拾遗》中便有关于博落回的记载[1],在我国自古便应用于消毒、缓解肌肉疼痛等症状[2]。博落回的主要生物学成分是血根碱、白屈菜红碱等生物碱,其在动物体内不容易被消化吸收,大部分都通过消化道直接排泄出来,仅有少部分在体内发挥作用[3],因此动物产品中也不易有残留,不会危害到人体健康[4]。

我国自2020年7月1日起全面禁止在饲粮中添加促生长类抗生素来提高动物生长性能,各种替抗产品层出不穷,其中,博落回提取物具有促生长、抗氧化和抗炎特性,可提高动物的抗氧化能力和免疫性能,是一种理想的抗生素替代产品。邹朋[5]发现,饲粮中添加博落回提取物可提高蛋鸡的抗氧化能力和产蛋率;夏超笃等[6]发现,饲粮中添加博落回提取物可显著提高断奶仔猪血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,降低血清丙二醛(MDA)含量;曾泽等[7]发现,博落回提取物可以降低副猪嗜血杆菌诱导的猪肺泡巨噬细胞炎症反应,主要表现为白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎因子的mRNA表达量下调。目前,博落回提取物在鸡、猪上的研究较为常见,但在番鸭上鲜有报道。博落回散为博落回提取物经加工制成的散剂,是国家批准的二类替抗中兽药及药物饲料添加剂,已列入《药物饲料添加剂品种目录》。在肉鸡上的研究显示,博落回散可提高肉鸡的生长性能,改善肠道黏膜发育,提高机体抗氧化能力,在肉鸡生长中可以替代饲用促生长抗生素使用[8]。本试验在番鸭饲粮中添加不同水平的博落回散,拟探究对番鸭生长性能、肉品质、免疫器官指数、血清抗氧化指标和回肠促炎细胞因子基因表达的影响,旨在为博落回在番鸭上的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

博落回散(主要有效成分为白屈菜红碱和血根碱)由湖南某生物资源股份有限公司提供,总碱含量为3.75%,其中白屈菜红碱含量为1.25%,血根碱含量为2.50%。

1.2 试验设计与饲养管理

试验选用1日龄健康雄性番鸭360羽,预饲7 d后[体重(147.58±9) g]随机分为6组,每组6个重复,每个重复10羽。对照组(CON组)饲喂基础饲粮,抗生素组(ANT组)在基础饲粮中添加25 mg/kg金霉素,试验组(T1～T4组)分别在基础饲粮中添加10、20、40和80 mg/kg的博落回散,正式试验期为49 d。试验所用基础饲粮参考NRC(1994)鸭营养需要和《肉鸭饲养标准》(NY/T 2122—2012)配制,其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

饲养试验在浙江省湖州市南浔区海冠农业发展有限公司养殖基地开展,采用网上平养模式,按照常规饲养管理程序进行。0～3周龄控制室内地面温度维持在25 ℃左右,之后维持在22 ℃左右。试验期间保证番鸭自由饮食和饮水,定期进行鸭舍消毒和通风换气。

1.3 样品采集与制备

饲养试验结束(56日龄)时,从每个重复中随机选取1羽番鸭(体重接近组均重),禁食12 h后采血5 mL置于促凝管中,37 ℃水浴5 min,3 500 r/min离心10 min分离出血清,分装到1.5 mL Eppendorf管后,放入-80 ℃冰箱中保存;采血后将所选番鸭屠宰,统一采集左侧胸肌和回肠段,用液氮预冷后干冰运输到实验室,-80 ℃冰箱保存。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长性能

饲养试验开始(7日龄)时称取雏鸭体重,以重复为单位记录每周的采食量,并在56日龄空腹称重,计算出各组番鸭的7日龄体重、56日龄体重、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)。

1.4.2 肉品质

胸肌肉品质检测方法参考NY/T 1333—2007。左侧胸肌冷藏24 h后,采用便携式pH计测定3个不同位点pH,结果取平均值(记为pH24 h);采用SP60系列肉色仪(x-rite,美国)测定胸肌3个不同位点颜色[亮度(L*)值、红度(a*)值和黄度(b*)值]。另取5 cm×3 cm×2 cm的左侧胸肌,拭去表面水分后称量其初始重(记为m1),将其在4 ℃悬挂24 h后,用滤纸吸干表面水分,称量所得的重量(记为m2);然后将其包在自封袋中蒸煮至中心温度约75 ℃,取出并用滤纸拭去表面水分,称取重量(记为m3)。根据上述记录的重量计算滴水损失和蒸煮损失,计算公式如下:

滴水损失(%)=[(m1-m2)/m1]×100;蒸煮损失(%)=[(m1-m3)/m1]×100。

1.4.3 血清抗氧化指标

血清中总抗氧化能力(T-AOC)与超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及MDA含量采用南京建成生物工程研究所生产的相应试剂盒测定,操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.4 回肠黏膜中促炎细胞因子mRNA相对表达量

采用实时荧光定量PCR测定回肠黏膜中炎症相关基因白细胞介素-2(IL-2)、IL-6、TNF-α的mRNA相对表达量。引物序列见表2。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,各目的基因的mRNA相对表达量采用2-ΔΔct法计算。

表2 引物序列

1.4.5 免疫器官指数

番鸭屠宰后,完整取出胸腺、脾脏和法氏囊,滤纸擦净上面的血渍,剔除附着在组织上的脂肪后,称重并计算相应的免疫器官指数,计算公式如下:

某免疫器官指数=(该免疫器官鲜重/

宰前活重)×100。

1.4.6 免疫器官组织结构

切取脾脏及法氏囊组织固定于多聚甲醛溶液,并经脱水、包埋后制备切片,苏木精-伊红(HE)染色后观察组织结构。

1.5 数据统计与分析

试验数据使用SPSS 25.0软件的one-way ANOVA程序进行单因素方差分析,采用Duncan氏法进行组间多重比较,结果用“平均值±标准差”表示;利用线性和二次方程拟合博落回散添加量(0～80 mg/kg)的影响。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 博落回散对番鸭生长性能的影响

由表3可知,随着博落回散添加量的增加,番鸭的56日龄体重、平均日增重呈一次线性增加(P<0.001)。T3组番鸭56日龄体重、平均日增重较CON组显著升高(P<0.05),且与ANT组无显著差异(P>0.05)。饲粮中添加博落回散对番鸭平均日采食量和料重比无显著影响(P>0.05)。上述结果表明,饲粮中添加40 mg/kg博落回散可显著提高番鸭平均日增重。

2.2 博落回散对番鸭肉品质的影响

由表4可知,随博落回散添加量的增加,番鸭滴水损失(P<0.001)、蒸煮损失(P=0.030)呈二次曲线变化。T3组胸肌滴水损失、蒸煮损失显著低于CON组(P<0.05),且蒸煮损失还显著低于ANT组(P<0.05)。饲粮中添加博落回散对番鸭胸肌肉色(L*值、a*值、b*值)和pH24 h无显著影响(P>0.05)。上述结果表明,饲粮中添加40 mg/kg的博落回散可显著降低番鸭胸肌滴水损失和蒸煮损失,提高胸肌的持水能力。

2.3 博落回散对番鸭血清抗氧化指标的影响

由表5可知,随博落回散添加量的增加,番鸭血清T-AOC(P=0.009)、SOD(P=0.002)与GSH-Px活性(P=0.002)及MDA含量(P<0.001)呈二次曲线变化。与CON相比,T1、T2和T3组血清T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性均不同程度提高,MDA含量均有不同程度降低,其中T3组血清T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性较CON组显著提高(P<0.05),MDA含量较CON组显著降低(P<0.05);除T-SOD活性外,T3组血清其他抗氧化指标与ANT组无显著差异(P>0.05)。上述结果表明,饲粮中添加40 mg/kg博落回散可提高番鸭的抗氧化能力。

2.4 博落回散对番鸭免疫器官指数的影响

由表6可知,随博落回散添加量的增加,脾脏指数(P=0.031)和法氏囊指数(P=0.006)呈二次曲线变化。T2和T3组脾脏指数显著高于CON组(P<0.05),且与ANT组无显著差异(P>0.05)。

2.5 博落回散对番鸭免疫器官组织结构的影响

如图1所示,各组番鸭脾脏结构正常,红髓和白髓界限清楚,结构完整;脾小结结构清晰,边界清楚;脾小结及动脉周围淋巴鞘内淋巴细胞形态正常且排列紧密有序。与CON组相比,T2和T3组番鸭脾脏脾小结直径增大,动脉周围淋巴鞘增厚,内部淋巴细胞排列更加密集,但与ANT组无明显差异。上述结果表明,饲粮中添加20～40 mg/kg博落回散可有效促进番鸭脾脏发育。如图2所示,各组番鸭法氏囊发育良好,黏膜皱襞内淋巴滤泡排列整齐,淋巴滤泡中皮质和髓质分界清晰。与CON组相比,T2、T3组法氏囊中的淋巴滤泡数明显增加,淋巴滤泡排列更加紧密,皮质层厚度增加,但与ANT组无明显差异。

2.6 博落回散对番鸭回肠黏膜中促炎细胞因子基因表达的影响

由表7可知,番鸭回肠黏膜中IL-2(线性P<0.001;二次P=0.024)、IL-6(线性P=0.039;二次P<0.001)、TNF-αmRNA相对表达量(线性P=0.005;二次P=0.001)随博落回散添加量的增加呈一次线性降低或二次曲线变化,其中T2和T3组回肠黏膜中IL-2、IL-6、TNF-αmRNA相对表达量显著低于CON组(P<0.05)。上述结果表明,饲粮中添加20～40 mg/kg博落回散可显著降低回肠黏膜中促炎细胞因子IL-2、IL-6和TNF-α基因的表达。

3 讨 论

3.1 饲粮中添加博落回散对番鸭生长性能的影响

博落回的主要活性物质为血根碱和白屈菜红碱等异喹啉类生物碱,可通过提高抗氧化、抗炎、抑菌起到促生长的效果[9-10]。李长虹等[11]报道,博落回散可显著提高肉鸭的平均日采食量。刘梦婷等[12]发现,饲粮中添加推荐剂量的博落回散能显著促进肉鸡1～21日龄的平均日增重、平均日采食量,并显著降低其料重比。Liu等[13]报道,博落回提取物中的活性成分血根碱可显著增加1～28日龄肉鸡的平均日增重和平均日采食量,显著降低肉鸡的料重比,但对1～56日龄肉鸡的生长性能无显著影响,说明博落回散对肉鸡生长性能的作用受日龄影响。本试验结果显示,饲粮中添加40 mg/kg博落回散可显著提高番鸭的平均日增重,与上述前人的结果基本一致,其原因可能是博落回散提高了番鸭机体的抗氧化能力和免疫水平,降低了机体炎症细胞因子的表达,从而使机体处于一个相对健康的状态,更有利于生长;同时,本试验还发现博落回散有促进番鸭平均日采食量提高的趋势,推测与博落回散中的血根碱可降低肠道芳香氨基酸的脱羧作用,通过调节肠道pH和通过色氨酸(Trp)-5-羟色胺(5-HT)途径来增加饲粮摄入量相关[13-14]。但是,本试验并未发现博落回散能显著影响番鸭的料重比,与前人研究结果不一致的原因可能与试验动物品种、试验条件及养殖周期等诸多因素有关,有待进一步探究。

表3 博落回散对番鸭生长性能的影响

表4 博落回散对番鸭肉品质的影响

A:小动脉; RP:红髓; SN:脾小结; PALS: 动脉周围淋巴鞘。

★:皮质;▲:髓质;←:中间层上皮网状细胞。

3.2 饲粮中添加博落回散对番鸭血清抗氧化指标的影响

动物机体在日常活动中会产生大量的氧自由基,体内相应地有一套抗氧化系统,可以清除自由基。当氧化和抗氧化处于平衡状态时,机体则处于一个健康状态,体内低水平的活性氧还能作为信号传递分子,促进机体基因转录以及组织的生长发育;当机体抗氧化水平不够或者产生过多氧自由基时,则平衡被打破,机体产生氧化应激。过度的氧化应激往往伴随着炎症,影响动物的生长。血根碱能有效地清除自由基,保护脂质和DNA的完整[15]。黄亚明等[16]发现,博落回可显著增加罗非鱼肝脏CAT和T-SOD活性。邱全优等[17]发现,母源性博落回提取物能显著提高发育迟缓的断奶仔猪血清T-SOD和GSH-Px活性,降低血清MDA含量。邹朋[5]发现,博落回提取物可显著提高蛋鸡肝脏中CAT、GSH-Px、T-SOD等抗氧化酶的活性及mRNA相对量。本试验结果与上述研究报道基本一致,饲粮中添加40 mg/kg博落回散显著提高了番鸭血清T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性,显著降低了血清MDA含量。

表7 博落回散对番鸭回肠黏膜促炎细胞因子基因表达的影响

3.3 饲粮中添加博落回散对番鸭肉品质的影响

较高的持水能力可维持肌肉的嫩度,滴水损失和蒸煮损失是反映肌肉持水能力的重要指标。研究发现,饲粮中添加博落回可不同程度降低肉鸡肌肉的滴水损失和失水率[18],饲粮中添加博落回散可降低育肥猪肌肉的滴水损失和失水率[19]。王波等[20]报道,肌肉的滴水损失与机体抗氧化能力呈正相关。大量的氧化反应易造成肌肉pH升高,进而蛋白质达到等电点,降低其静电作用,产生肌肉的凝集效应,肌纤维收缩,空间中的水分被挤压,水分流失加速。此外,氧化损伤、环境改变等其他因素造成细胞磷脂双分子层的破坏也会导致细胞水分的流失。本研究中,饲粮中添加40 mg/kg博落回散显著降低了番鸭胸肌滴水损失和蒸煮损失,这可能与博落回散显著改善了机体抗氧化能力有关。

3.4 饲粮中添加博落回散对番鸭免疫器官指数和组织结构的影响

家禽最主要的免疫器官有胸腺、脾脏和法氏囊。胸腺和法氏囊是家禽的中枢免疫器官,是机体T淋巴细胞和B淋巴细胞发育、分化和成熟的主要场所;脾脏是机体最大的外周淋巴免疫器官,也是淋巴细胞定居和对抗原刺激进行免疫应答的场所[21]。免疫器官指数的增加通常代表免疫器官发育良好且有更多免疫细胞的聚集,从而提升机体的免疫机能[22],因此,一般认为免疫器官指数可反映机体免疫功能的强弱[23]。研究发现,博落回及其提取物可提高的动物的免疫器官指数,显著提高机体免疫机能。例如,王曼等[24]发现,博落回提取物可显著提高蛋雏鸡的法氏囊指数,并有提高脾脏指数的趋势;祝凯[25]发现博落回提取物可提高6周龄蛋鸡的法氏囊指数和12周龄蛋鸡的胸腺指数。本试验中,饲粮中添加博落回散显著提高了番鸭的脾脏指数和法氏囊指数,表明博落回散对脾脏和法氏囊的免疫应答具有调节作用。一般认为,动物免疫器官重量的增加是由其自身细胞生长发育和分裂增殖所致,进一步对脾脏和法氏囊组织结构进行分析,发现饲粮中添加20或40 mg/kg博落回散可促进番鸭脾脏和法氏囊的发育。脾小结和动脉周围淋巴鞘存在着大量淋巴细胞,脾小结和动脉周围淋巴鞘的大小可反应脾脏的发育情况[26]。欧淑琦等[27]研究发现,博落回中的活性成分血根碱可有效增加肉鸡脾小结直径和动脉周围淋巴鞘面积。本试验中,饲粮中添加20或40 mg/kg博落回散增加了番鸭脾小结直径和动脉周围淋巴鞘面积,与前人研究结果一致。法氏囊淋巴滤泡的大小、数量及排列紧密程度均与番鸭机体的免疫功能相关[26]。法氏囊小结结构排列紧密可促进B淋巴细胞输出,使法氏囊的免疫功能提高。本试验中,饲粮中添加20或40 mg/kg博落回散可改善法氏囊小结结构排列,增加了法氏囊淋巴滤泡数量,表明博落回可促进番鸭法氏囊发育,提高番鸭法氏囊的免疫应答能力。

3.5 饲粮中添加博落回散对回肠黏膜促炎细胞因子基因表达的影响

炎症反应是机体对抗外界病原体等因素造成组织损伤所进行的一个正常生理反应,促炎细胞因子IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等的含量可反映机体炎症水平[28]。核转录因子-κB(NF-κB)是炎症反应中的关键调控因子[29],可有效调控IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子基因的表达。研究显示,博落回中的活性成分白屈菜红碱可通过影响CC趋化因子配体-2(CCL-2)、IL-6基因的表达来对抗炎症[30]。邹朋[5]研究发现,饲粮中添加博落回提取物可显著降低蛋鸡肠道组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-6、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)等促炎细胞因子的mRNA表达水平,同时发现肠道NF-κB的转录水平相应降低。本试验结果发现,饲粮中添加博落回散可显著降低番鸭回肠黏膜中促炎细胞因子IL-2、IL-6、TNF-αmRNA的相对表达量,推测可能是基于肠道炎症调控NF-κB表达,进而发挥其降低回肠黏膜炎症水平的作用。

4 结 论

在本试验条件下,饲粮中添加40 mg/kg博落回散可提高番鸭的生长性能和肉品质,促进脾脏和法氏囊发育,改善机体免疫性能和抗氧化能力。