辣蓼与全株玉米混合青贮对青贮品质和有氧稳定性的影响

卞彬彬 赵峻祥 郑杨晨 孔令芝 刘宇洋 李井春 李雁冰*

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室,大庆 163319;2.农业农村部东北平原农业绿色低碳重点实验室,大庆 163319)

近年来,随着我国“粮改饲”以及牧草相关政策的推进,青贮玉米种植面积逐步扩大,发展态势良好[1]。作为支撑我国草食畜牧业快速发展的优质饲草资源,青贮玉米具有生长周期短、产量高、适口性好等特点。随着现代畜牧业的发展,奶牛的养殖规模随之增加,疾病的传播途径也更加多样复杂,群发性疾病更加常见[2]。致病微生物常由食物及饮水进入畜禽体内,进而引发多种疾病[3]。常见的致病微生物包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等[4]。涂会鑫等[5]研究表明,由金黄色葡萄球菌诱发的奶牛乳房炎,在奶牛场感染率高达50%。李彦霞等[6]指出,大肠杆菌在感染奶牛乳房时会造成奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)的乳合成能力与分泌功能下降,从而导致产奶量下降。杨若璇等[7]研究表明,奶牛在感染沙门氏菌后通常会出现腹泻、产奶量降低、乳品质变差等问题,进而造成养殖行业的经济损失。而且,有大量研究表明,上述3种致病菌能在人和动物之间进行传播感染,造成人畜共患病[8-9]。

在动物生产中,为了防止畜禽感染,最有效的方法是采取抗生素治疗,而在养殖期间滥用抗生素不仅会增强致病菌的耐药性,而且还会使药物在畜禽体内残留,对动物产品质量造成严重的影响[10]。农业农村部公告指出,自2020年1月1日起,禁止在饲料中添加除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂[11]。目前,能够抑制病原微生物的饲料添加剂主要有乳酸菌添加剂、化学添加剂、抗菌肽、天然多糖和中草药添加剂等[12]。我国利用中草药治疗禽畜疾病具有悠久的历史[13],中草药添加剂具有无毒、无污染、无耐药性、无残留等特点[14],且种类多、来源广泛、成本低廉,因此,其作为饲料添加剂的应用越来越广泛[15]。

辣蓼(PolygonumhydropiperL.)为蓼科(Polygonaceae)蓼属(Polygonum)植物,别名水蓼、大马蓼、水蓼草等,在中国大部分地区都有分布,是一种资源丰富、价格低廉的植物[16]。有研究表明,辣蓼全草均可入药,具有清热解毒、除湿、活血化瘀的作用[17]。在《本草纲目》中就有“古人种蓼为蔬,收子入药”这样的记载[18]。路熙强[19]研究表明,辣蓼具有治疗子宫出血、清除畜禽肠道寄生虫和畜禽痢疾的功效;陶俊宇等[20]将复方辣蓼散作为饲料添加剂研究其对肉鸡生长性能的影响,结果表明复方辣蓼散有效提高了肉鸡屠宰率和抗氧化能力;黄立等[21]将辣蓼与木薯渣进行青贮,青贮后产物中的黄酮、蛋白质等营养指标含量均显著提升。有研究表明,辣蓼中含有大量的具有抑菌作用的黄酮类化合物,例如槲皮素、金丝桃苷等[22-23],这些物质具有促进生长、增强免疫机能、抗氧化的作用[24],且能明显抑制金黄葡萄球菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌生长[25-26]。

蓼属植物中的活性成分种类繁多,具有多种功效,对畜禽健康、动物产品安全具有重要的意义。然而,关于辣蓼在青贮玉米中的抑菌作用、营养及药用价值鲜见报道。综上所述,本研究采用非靶向代谢组学手段分析辣蓼中主要代谢物以及添加不同比例辣蓼与全株玉米混合青贮,探究对其抑菌能力、青贮品质和有氧稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验原料

全株玉米于2020年9月中旬采自黑龙江省大庆市(坐标位置:北纬46°32′13.28″,东经125°14′12.38″),全株辣蓼同年9月采自黑龙江省大庆市与安达市交界处(坐标位置:北纬46°31′8.46″,东经125°16′40.18″)。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌由黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医研究室分离、鉴定,由黑龙江八一农垦大学动物科技学院动物营养研究所保存。

1.2 辣蓼非靶向代谢组测定与分析

1.2.1 乙酸乙酯提取液的制备

精密称取辣蓼干燥粉末10 g放入圆底烧瓶,加入浓度为60%的乙醇300 mL,水浴温度为80 ℃,100 W超声提取50 min,提取3次,合并3次滤液,将布氏漏斗插入抽滤瓶后连接真空水泵,将滤液倒入抽滤药渣,将抽滤后的样液放入旋转蒸发仪蒸干,浸膏采用蒸馏水定容至10 mL,制得乙醇提取液[27]。将乙醇提取后的辣蓼提取液进行蒸干,蒸干后的浸膏混悬于适量蒸馏水中,按体积比1∶1加入乙酸乙酯,振荡混合后静置2 h,将上层液体倒出,得乙酸乙酯萃取液。继续按体积比1∶1加入乙酸乙酯,萃取操作重复3次后合并3次萃取液,旋转蒸发,将浸膏用蒸馏水定容至10 mL,121 ℃高压灭菌15 min,制得乙酸乙酯无菌提取液[28]。

1.2.2 色谱条件

色谱条件:Thermo Vanquish(Thermo Fisher Scientific)超高效液相系统,使用ACQUITYUPLC®HSS T3(2.1 mm×150 mm, 1.8 μm)(Waters, Milford)色谱柱,0.25 mL/min的流速,40 ℃的柱温,进样量2 μL。正离子模式,流动相为0.1%甲酸乙腈(B2)和0.1%甲酸水(A2),梯度洗脱程序为:0～1 min,2% B2;1～9 min,2%～50% B2;9～12 min,50%～98% B2;12～13.5 min,98% B2;13.5～14 min,98%～2% B2;14～20 min,2% B2。负离子模式,流动相为乙腈(B3)和5 mmol/L甲酸铵水(A3),梯度洗脱程序为:0～1 min,2% B3;1～9 min,2%～50% B3;9～12 min,50%～98% B3;12～13.5 min,98% B3;13.5～14 min,98%～2% B3;14～17 min,2% B3。质谱条件Thermo Q Exactive Focus质谱检测器(Thermo Fisher Scientific),电喷雾离子源(ESI),正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50 kV,负离子喷雾电压为-2.50 kV,鞘气30 arb,辅助气10 arb。毛细管温度325 ℃,以分辨率70 000进行一级全扫描,一级离子扫描范围m/z 100～1 000,并采用HCD进行二级裂解,碰撞能量为30 eV,二级分辨率为17 500,采集信号前3离子进行碎裂,同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

1.2.3 非靶向代谢组数据分析

通过Proteowizard软件包(v3.0.8789)[29]中MSConvert工具将原始质谱下机文件转换为mzXML文件格式。采用R XCMS软件包[30]进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理,得到物质定量列表,参数设置有bw=2,ppm=15,peakwidth=c(5, 30),mzwid=0.015,mzdiff=0.01,method=‘centWave’。采用公共数据库HMDB[31]及自建物质库进行物质的鉴定,参数设置为ppm<30 ppm。采用总峰面积归一化的方法实现数据校正,消除系统误差。

亚铁离子螯合力、DPPH自由基清除能力以及总还原力均属于酶解产物抗氧化能力的评价指标，从图2～4可以看出各指标的结果并不完全一致，导致这一结果的原因可能是不同方法的机理不同以及酶解产物抗氧化体系的复杂性[17]。总体而言，胃蛋白酶酶解产物的抗氧化性较强。

1.3 抑菌试验

在青贮30 d开封时,取120 g青贮饲料添加1×105CFU/mL的大肠杆菌、金黄葡萄球菌、沙门氏菌混匀,取实验室无菌样品袋,将每袋120 g的饲料平均分装到12个样品袋中,每袋约为10g,用真空封口机封口,放置室温下青贮。设置4个不同青贮时间:8、24、48和72 h,分别在对应时间使用平板涂布法检测3种有害菌数量。

1.4 试验设计

将新鲜辣蓼放置实验室阴干,阴干后使用粉碎机粉碎,将粉碎后的样品放进实验室无菌样品袋保存备用。将全株玉米切成2～3 cm,设置3个组,以无添加辣蓼记为对照组,以分别添加5%、10%辣蓼为添加组,每组设置3个重复,重300 g,分别装入聚乙烯袋中,使用真空包装机进行真空包装。置于通风阴凉处分别在3、7、14、30 d进行开封检测。青贮原料组成见表1。

表1 青贮原料组成

1.5 全株玉米青贮检测指标及方法

开封后的青贮饲料放置于65 ℃电热鼓风干燥箱(DGG-9240B,上海森信实验仪器有限公司),称量差值得出干物质含量。取开封的青贮饲料样本20 g分别与180 mL灭菌生理盐水(0.85%)混合,并逐层稀释,进行微生物数量的检测。参考刘宇洋等[32]的方法测定乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌数量(MRS培养基、VRBA培养基、PDA培养基购自青岛海博生物技术有限公司),使用电热恒温培养箱(DRP-9272,上海森信实验仪器有限公司)37 ℃培养48 h。用精密pH计(PSH-3C,上海虹益仪器仪表有限公司)测定pH并保留适量混合溶液。使用中速定性滤纸(102,杭州富阳北木浆有限公司)过滤后,利用高效液相色谱法测定有机酸的含量,色谱条件为:色谱柱Carbomix H-HP5(8%交联度,5 μm,8%交联度,7.8 mm×300 mm);流动相2.5 mmol/L硫酸,临用前用超声波脱气; 流速0.6 mL/min,进样10 μL;温度55 ℃,进样量10 μL,检测器为示差检测器。将青贮饲料样品放入1 L的聚乙烯罐中,罐口完全敞开,但使用双层医用无菌纱布覆盖防止干燥和污染,7 d后再次检测青贮饲料样本的pH,以此来检测青贮的有氧稳定性。

1.6 数据统计

使用Excel 2019进行初步处理。采用SPSS 23.0统计软件对数据进行单因素ANOVA分析,采用Duncan氏法进行多重比较,结果以“平均值±标准差”表示,均以P<0.05为差异显著性判断标准;采用SPSS 23统计软件中一般线性模型单变量方差分析实现交互效应的方差分析,均以P<0.05为具有显著交互效应判断标准,以P<0.01为具有极显著交互效应判断标准。

2 结果与分析

2.1 辣蓼代谢产物测定

由表2可知,对辣蓼乙酸乙酯萃取液成分进行筛选,选出表达量最高的前20个有效成分,其中,黄酮类化合物含有6种,其他类化合物包括酯类、醛类、萜类、维生素类苯醌类、环氧类和其他化合物。

表2 辣蓼乙酸乙酯萃取液中表达量高的前20个代谢产物

2.2 添加辣蓼对青贮玉米的抑菌效果

由表3可知,青贮30 d后开封接种有害菌,对照组和5%辣蓼组在8 h时检测到了3种有害菌,有害菌数量显著低于对照组(P<0.05),10%辣蓼组在8 h只检测到了沙门氏菌,且沙门氏菌数量显著低于5%辣蓼组和对照组(P<0.05),菌数为2.36 lg(CFU/g);24 h时,对照组3种有害菌数量降低,5%辣蓼组只检测到了沙门氏菌,数量为2.10 lg(CFU/g),10%辣蓼组3种有害菌均未检出;48 h后3组均未检测到有害菌。

表3 青贮30 d后添加辣蓼对青贮玉米抑菌效果的影响

2.3 辣蓼与全株玉米混合青贮对青贮品质和有氧稳定性的影响

2.3.1 添加辣蓼对青贮玉米青贮品质的影响

相同天数,不同大写字母表示同一青贮天数不同添加量之间的差异显著(P<0.05);相同组,不同小写字母表示相同添加量不同青贮天数之间差异显著(P<0.05)。T:表示青贮天数;G:表示添加量;T×G:表示青贮天数和添加量的交互作用。下图同。

由图2可知,不同青贮时间和不同添加量对青贮玉米的各项发酵品质指标均有显著影响(P<0.05),两者的交互作用对各项指标均有显著影响(P<0.05)。对照组和5%辣蓼组pH随着青贮时间的延长呈现先升高后降低的趋势,10%辣蓼组pH逐渐降低,青贮14和30 d时2个辣蓼组的pH显著低于对照组(P<0.05)。辣蓼组乳酸含量随着青贮的进行呈现先升高后降低的趋势,青贮14 d时各辣蓼组乳酸含量均达到最高。对照组乳酸含量先降低后升高,在7 d时达到最低,青贮7 d后2个辣蓼组乳酸含量均显著高于对照组。各组乙酸含量均呈现先增高后降低的趋势,青贮14 d时均达到最高。5%辣蓼组乙酸含量在青贮前14 d均高于其他2组。辣蓼组乳酸菌数量随着青贮的进行逐渐升高,青贮30 d时5%辣蓼组乳酸菌数量显著高于10%辣蓼组(P<0.05)。对照组乳酸菌数量呈现先降低后升高的趋势。各组酵母菌数量均呈现逐渐降低的趋势,5%辣蓼组酵母菌数量在青贮3 d后各时期均显著低于10%辣蓼组和对照组(P<0.05),青贮30 d时达到最低。各组大肠杆菌的数量均呈现逐渐降低的趋势,且在青贮30 d时均未检出。10%辣蓼组大肠杆菌数量在青贮7 d时显著降低(P<0.05),在青贮14 d时未检出,对照组大肠杆菌数量降低速率小于辣蓼组。

2.3.2 添加辣蓼对青贮玉米有氧稳定性的影响

由表4可知,青贮玉米添加辣蓼后,各组在开封当天和有氧暴露后7 d所测的pH均差异显著,且pH显著升高(P<0.05)。青贮3 d有氧暴露测得10%辣蓼组pH显著高于其他2组(P<0.05)。青贮7 d有氧暴露测得10%辣蓼组pH显著低于对照组和5%辣蓼组(P<0.05)。青贮14、30 d有氧暴露,测得10%辣蓼组pH显著低于对照组(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 添加辣蓼对青贮玉米抑菌效果的影响

对照组青贮玉米在8和24 h时均检测到了3种有害菌,10%辣蓼组只在8 h时检测到了沙门氏菌。辣蓼组有害菌数量减少的原因可能与辣蓼以及全株玉米中的黄酮类化合物有关。大量研究发现,玉米穗、玉米须、玉米花粉和玉米籽粒中都存在黄酮类化合物[33-34]。Adom等[35]研究表明,玉米中87%的酚类化合物存在于麸皮和胚乳中,且自身的黄酮类化合物与其总抗氧化能力直接相关。Agati等[36]研究发现,黄酮类化合物在B环C-3′上额外的自由羟基(-OH)的取代使其具有更强的清除活性氧能力。此外,黄酮类化合物中最活跃的羟基,如黄酮中的7-OH或黄酮醇中的3-OH,通常被糖基化,使其在细胞环境中更容易溶解,利于保护活性羟基免受自身氧化[37],植物自身的这种抵抗氧化反应的能力可能与青贮过程中辣蓼的抗菌成分相互协同,从而起到联合抑制有害菌的作用。闫佳佳等[38]通过提取汉麻叶中的黄酮成分,并通过抑菌试验证明黄酮类化合物能够对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌起到抑制作用。宋立立[39]研究表明,银杏叶中的黄酮成分可以有效抑制病原微生物的生长,将其作为饲料添加剂可以有效提高动物生长性能和治疗由细菌引起的疾病,对产气型肠杆菌和大肠杆菌均有良好的抑制效果;李程野等[40]通过对3种黄酮类化合物抑制沙门氏菌的抑菌试验得出,槲皮素具有抑制沙门氏菌的能力,且研究表明中草药中所含的黄酮类化合物对致病菌具有很好的抗菌活性[41-42]。Naeem等[43]通过用不同有机溶剂提取贯叶连翘中的黄酮类化合物,通过定量和定性分析,检测出主要成分为山奈酚、异鼠李素、槲皮素等,并通过96孔法进行抑菌试验,结果表明,黄酮类化合物对于大肠杆菌和绿脓杆菌具有抗菌活性;戴燊等[44]研究表明,中草药经发酵后,在微生物的作用下,将中草药细胞壁破坏,使其含有的活性成分大量释放,对于提高饲料的营养价值有显著的影响,从而增强畜禽抵抗疾病的能力,值得一提的是,黄酮类化合物的抑菌机制是其高效抑菌能力的基础;辣蓼与青贮原料长时间青贮后,对3种有害菌的抑制能力明显增强,这与青贮对于代谢产物药效增强或产生了新的抑菌成分有关。有研究表明,黄酮类化合物的抗菌机理主要有:抑制核酸的生成、抑制微生物的附着作用以及生物膜的形成、改变细胞膜的通透性、抑制能量代谢等[45]。但其代谢产物在青贮过程中的具体变化及机理还需进一步研究。

表4 有氧暴露过程中青贮玉米pH的变化

3.2 添加辣蓼对青贮玉米青贮品质的影响

本试验青贮玉米原料各组干物质含量为28%左右,研究表明此时的干物质含量适宜青贮[46]。张金山等[47]研究表明,云南沙棘果实中3种主要黄酮类化合物对4种病原菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)具有抑制作用。本试验中,对照组水溶性碳水化合物含量在青贮后期呈现降低的趋势,而2个辣蓼组水溶性碳水化合物含量未显著降低,可能是由于辣蓼的添加抑制了某些微生物的活动,导致水溶性碳水化合物的利用下降。邵越楣等[48]研究表明,桂花黄酮能够对白色念珠菌形成抑制作用,是由于黄酮阻碍了其生物膜的早期形成。中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维是评价青贮纤维品质的主要营养指标[49]。Zhan等[50]研究表明,苜蓿黄酮提取物能提高瘤胃微生物群落的丰度和多样性,本试验中2个辣蓼组中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量在青贮后期均低于对照组,可能是由于辣蓼中的黄酮类物质促进了某些纤维素分解菌的生长。本试验中,2个辣蓼组的粗蛋白质含量在青贮后期显著高于对照组。梁小玉等[51]研究表明,全株玉米和菊苣以1∶1等比例混合青贮后其粗蛋白质含量显著升高,中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著降低。孙小龙等[52]将玉米秸秆和苜蓿混合青贮,研究结果表明,随着苜蓿添加量的增加,混贮中粗蛋白质含量升高,中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量降低。唐庆凤等[53]将桑枝叶与玉米秸秆以不同比例混合贮存,研究发现,提高桑枝叶的比例,增加了混合青贮中粗蛋白质的含量,降低了粗纤维含量,与本试验研究结果一致。本试验中,对照组各时期粗脂肪含量差异不显著,10%辣蓼组在青贮后期粗脂肪含量显著升高,蒋金娟等[54]将全株玉米与甘蔗梢以7∶3混贮,随着甘蔗梢添加比例的增加,混贮料的粗脂肪含量在后期显著升高,这与本研究结果相一致,5%辣蓼组粗脂肪含量呈现先升高后下降的趋势可能是由于辣蓼添加量较低导致。Huang等[55]研究指出,中药渣中含有大量的粗脂肪、粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维等营养物质,且价格低廉,将其应用于玉米青贮中能够改善青贮饲料的营养品质。由此可见,可以通过向青贮玉米中加入不同原料进行混合青贮,来实现营养的均衡,改善青贮品质。

pH是评价青贮品质的重要指标之一,优良青贮饲料的标准是pH在4.0以下[56],当pH降低时,可以有效抑制饲料中有害菌的增殖[57]。本研究中,对照组pH高于4,随着辣蓼的添加,辣蓼组的pH逐渐降低到4以下,说明辣蓼的添加能够降低青贮饲料的pH,改善青贮品质。有机酸总量和种类构成也是反映青贮饲料青贮品质的重要指标,乳酸和乙酸含量是其中的关键因素,乳酸的含量越高,青贮饲料的品质越好,乙酸能够提高青贮饲料的有氧稳定性,并且能在防止氧化变质方面发挥重要作用。李君风等[58]在青贮苜蓿和西藏燕麦共同青贮时添加乙酸,结果表明,添加乙酸组有氧稳定性提升。本试验中,辣蓼添加组青贮14 d时乳酸和乙酸的含量随着辣蓼的添加不断升高,10%辣蓼组在青贮30 d后,各组乳酸菌数量最高,此时的青贮更为稳定。杨君等[59]研究表明,生地黄不同添加量可以促进保加利亚乳杆菌的增殖。酵母菌在有氧环境下进行活动,进而使青贮发生霉变腐败[60],青贮腐败变质与酵母菌的数量和种类有关,引起腐败的酵母菌可以分为2类:一类为可以消化乳酸,一类为可以消化水溶性碳水化合物[61]。王雁[62]向紫花苜蓿中添加党参、当归和黄芪等中草药,结果表明,辣蓼组的乳酸含量和乳酸菌数量均显著高于对照组,本试验与其结果相一致。

3.3 添加辣蓼对青贮玉米有氧稳定性的影响

青贮饲料在取用时与空气接触,此时空气中的氧气会侵入饲料,激活受到抑制的好氧微生物使其代谢活动加强pH升高,对有氧稳定性带来不好的影响,使青贮饲料发生霉变。影响饲料有氧稳定性的微生物包括酵母菌、霉菌等其他好氧型细菌[63]。本试验中,在青贮各个时期进行开封取样,进行7 d有氧暴露试验。取青贮14、30 d进行有氧暴露,10%辣蓼组7 d后青贮pH升高幅度小于5%辣蓼组和对照组。这说明10%辣蓼组有氧稳定性更好,对照组有氧稳定性差。辣蓼中乙酸乙酯萃取液表达量最高的代谢产物主要为黄酮类化合物、苯酚类化合物、酯类化合物等。研究表明,黄酮类化合物是蓼属植物最主要的次生代谢产物,广泛存在于蓼属植物中,具有抗氧化、抗病毒、抗菌等作用[24],与本研究结果一致。

4 结 论

① 抑菌试验中,10%辣蓼组在8和24 h时均未检测到大肠杆菌和金葡萄球菌,且沙门氏菌数量均低于其他2组,证明添加10%辣蓼能够在一定程度上抑制有害菌的增殖。

② 全株玉米青贮中添加5%或10%的辣蓼,在青贮达30 d时与对照组相比pH分别下降了0.20和0.28,显著降低了全株玉米青贮的pH。

③ 有氧暴露试验中,在有氧胁迫下14和30 d时,10%辣蓼组pH均显著低于对照组,证明添加10%辣蓼能够有效提高青贮的有氧稳定性。

④ 综上可知,辣蓼的添加对大肠杆菌、金葡萄球菌、沙门氏菌具有一定的抑制作用,且能够提高全株玉米青贮的品质,并延长其有氧稳定性。