硫酸亚铁和蛋氨酸螯合铁在草鱼实用膨化饲料中应用效果比较研究

徐光明 刘阿朋 董立学 陆 星 田 娟 文 华 易新文 柴 毅 蒋 明*

(1.长江大学动物科学学院,荆州 434025;2.中国水产科学研究院长江水产研究所,武汉 430223;3.深圳市澳华集团股份有限公司,深圳 518052;4.长江大学农学院,荆州 434025)

铁作为动物机体必需的微量元素之一,是血红蛋白、肌红蛋白及含铁酶(细胞色素氧化酶和过氧化氢酶等)的组成部分或激活因子,参与机体组织呼吸过程[1][1],并且,铁还与免疫细胞增殖和免疫器官成熟密切相关[2]。鱼类可通过肠黏膜和鳃膜吸收可溶性铁,但在自然状态下,水体中可溶性铁的浓度较低。在精养体系中,饲料中的铁几乎是养殖鱼类唯一的来源[3]。饲料中铁的添加形式主要有3种,即有机螯合铁、简单有机酸铁和无机铁[4]。蛋氨酸螯合铁是有机螯合铁中的一种,不仅毒性低,而且稳定性好[5-6],它的生物利用率是无机铁的1.25～1.85倍,吸收速度比无机铁高3～5倍[7]。目前关于硫酸亚铁和蛋氨酸螯合铁的应用效果研究主要集中在哺乳动物[8-10]、禽类[11-13]以及少量水生动物[5]上。研究表明,在饲粮中适当添加硫酸亚铁可以改善母猪[14]和肉兔[15]铁营养状况及抗氧化性能;在商品蛋鸡[16]和仔鸡[17]饲粮中添加蛋氨酸螯合铁更有利于其生产性能提高。以往的研究表明水产动物可更好的利用蛋氨酸螯合铁[5],但是也有部分研究表明水产动物对不同类型的铁元素利用效率无明显差异[18],还有研究表明实用饲料中补充铁抑制了水产动物的生长[19]。在商业饲料配方体系中,由于膨润土等饲料原料中铁含量较高,因此也存在饲料中是否需要额外补充铁的争议。

草鱼(Ctenopharyngodonidella)是我国养殖产量第一的淡水鱼类,2021年我国草鱼产量为576万t,占淡水渔业总量的18.08%[20]。草鱼也是代表性的草食性养殖鱼类,是重要的鱼类营养与饲料研究对象。因此,本研究在草鱼实用饲料中分别添加硫酸亚铁、蛋氨酸螯合铁以及二者的混合物(以铁元素计,二者比例为1∶1),采用工业化饲料工艺生产膨化饲料,在室内循环水养殖系统中养殖草鱼幼鱼8周,比较补充不同铁源饲料对草鱼生长性能、机体铁含量、血清生化指标和血液学指标的影响,以期确定草鱼实用膨化饲料中是否需要补充铁及适宜的铁源。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

采用草鱼实用配方配制4种试验饲料。对照饲料(T1组)不补充外源铁,另在对照饲料中补充不同来源的铁元素(112 mg/kg),分别为370 mg/kg硫酸亚铁(本次试验所用硫酸亚铁的铁元素有效含量为30%,T2组)、1 120 mg/kg蛋氨酸螯合铁(本次试验所用蛋氨酸螯合铁的铁元素有效含量为10%,T3组)以及190 mg/kg硫酸亚铁+560 mg/kg蛋氨酸螯合铁(2种铁源分别提供56 mg/kg的铁元素,T4组)。试验饲料组成及营养水平见表1。饲料原料经粉碎通过60目筛,按表1配比混合均匀,少量的组分采用逐级扩大法混合,然后用膨化机组制成Φ1.0 mm的颗粒饲料,每种饲料制作3 t,取中间段1包饲料用于试验,养殖试验期间储存于-4 ℃冰柜中。

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础)

续表1项目 Items组别 Groups T1T2T3T4营养水平 Nutrient levels/%3)水分 Moisture9.879.409.699.05粗蛋白质 Crude protein29.5729.4329.4229.49粗脂肪 Crude lipid5.915.715.866.30粗灰分 Ash8.678.088.988.80铁元素 Fe/(mg/kg)554.21655.01647.66662.41

1.2 养殖管理

养殖试验在长江水产研究所室内循环水养殖系统中进行。草鱼购回经4周驯养后,选择初始体重为(4.30±0.20) g的健康草鱼480尾,随机分配于16个养殖桶(直径1.0 m,水深0.75 m)中,每桶30尾,随机分为4组(每组4个养殖桶),分别投喂4种试验饲料。每日投喂2次(09:00及19:00),日投喂量为鱼体重的3%～5%,每2周称重1次,根据体重变化和摄食情况调整投喂量,每天记录试验鱼摄食及死亡情况,饲养周期为8周。饲养试验期间,水温在26～33 ℃,溶解氧浓度>5.0 mg/L,pH在7.4～7.6,总氨氮浓度<0.2 mg/L,自然光照。

1.3 样品采集

饲养试验结束后,禁食24 h,以养殖桶为单位进行计数和称重。每个养殖桶随机挑取6尾鱼,用75 mg/L的鱼安定(MS-222)溶液麻醉,分别测量其体长、体重,之后进行尾静脉采血,用于血常规指标和血清生化指标的测定,然后进行解剖,取内脏、肝脏并称其质量,用于计算肝体比、脏体比和肥满度等指标,并将肝脏组织用固定液固定,用于肝脏切片的制作。每个养殖桶再随机选取3尾鱼,保存于-40 ℃的冰箱中,用于全鱼的水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分等常规营养成分含量的测定。

1.4 指标测定

1.4.1 生长性能及形体指标的计算

根据以下公式,计算增重率(weight gain rate,WGR)、特定生长率(specific growth rate,SGR)、饲料系数(feed conversion ratio,FCR)、成活率(survival rate,SR)、肥满度(condition factor,CF)、肝体比(hepatosomatic index,HSI)、脏体比(viscerosomatic index,VSI)。

增重率(%)=(Wt-W0)×100/W0;
特定生长率(%/d)=(lnWt-lnW0)×100/t;
饲料系数=F/(Wt-W0);
成活率(%)=Nt×100/N0;
肥满度(g/cm3)=W×100/L3;
肝体比(%)=Wh×100/W;
脏体比(%)=Wv×100/W。

式中:Nt为终末尾数;N0为初始尾数;Wt为终末均重(g);W0为初始均重(g);W为体重(g);t为养殖时间(d);F为饲料摄入总质量(g);Wh为肝重(g);Wv为内脏重(g);L为体长(cm)。

1.4.2 常规营养成分含量的测定

试验饲料和全鱼水分含量采用105 ℃烘干恒重法测定,粗蛋白质含量采用凯氏定氮法的测定,粗脂肪含量采用索氏抽提法测定,粗灰分含量采用550 ℃马弗炉灼烧法测定。利用湿法消解-乙炔火焰原子吸收光谱法测定全鱼和试验饲料中铁元素的含量,先将样品用ETHOS UP型微波消解仪(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)消解,之后采用AA320N型原子吸收分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)检测吸光度,通过吸光度和标准曲线计算全鱼和试验饲料中铁元素含量。

1.4.3 血清生化指标的测定

采用BX-3010型全自动生化分析仪(希森美康,日本)测定血清中碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性以及白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)和总胆固醇(TCHO)的含量。

1.4.4 血常规指标的测定

采用BC-2800vet型全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)测定白细胞数目、红细胞数目、血小板数目、血红蛋白浓度、红细胞比容、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度变异系数、平均血小板体积、血小板分布宽度和血小板比容。

1.4.5 组织切片的观察

取多聚甲醛固定的肝脏,经流水冲洗、乙醇脱水、二甲苯透明、包埋等处理后用Leica 切片机制作成厚度5～6 μm的组织切片,经苏木精-伊红(HE)染色后用中性树脂封片,在显微镜下拍照,并分析图片。

1.5 数据处理与分析

试验数据采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用Turkey法进行组间多重比较,结果以平均值±标准差(mean±SD)表示,差异显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同铁源对草鱼生长性能和形体指标的影响

由表2可知,T3组草鱼的终末均重、增重率和特定生长率显著高于T1组(P<0.05),T2、T4和T3组的终末均重、增重率和特定生长率有依次上升趋势,但组间无显著差异(P>0.05)。T1组的肝体比显著高于T4组(P<0.05)。草鱼的初始均重、饲料系数、成活率、肥满度和脏体比各组之间无显著差异(P>0.05)。

表2 饲喂添加不同铁源饲料8周的草鱼的生长性能和形体指标

2.2 不同铁源对草鱼体成分和铁元素含量的影响

由表3可知,全鱼水分、粗蛋白质和粗灰分含量各组之间无显著差异(P>0.05)。T1和T3组的全鱼粗脂肪含量显著高于T2和T4组(P<0.05)。T1组全鱼铁元素含量显著低于T2、T4和T3组(P<0.05),而T2组的全鱼铁元素含量显著低于T3组(P<0.05)。

表3 饲喂添加不同铁源饲料8周的草鱼的体成分和铁元素含量

2.3 不同铁源对草鱼血清生化指标的影响

由表4可知,草鱼血清ALT活性和TG含量各组之间无显著差异(P>0.05)。T3组的血清TP和ALB含量显著高于T4和T1组(P<0.05),T2组显著高于T4组(P<0.05)。T1组的血清GLU含量显著高于其他各组(P<0.05)。T3和T2组的血清TCHO含量显著高于T4和T1组(P<0.05)。T3组的血清ALP活性显著高于T4和T1组(P<0.05),T2组显著高于T1组(P<0.05)。T1组的血清AST活性最高,显著高于其他各组(P<0.05),而T3组最低,显著低于其他各组(P<0.05)。

表4 饲喂添加不同铁源饲料8周的草鱼的血清生化指标

2.4 不同铁源对草鱼血常规指标的影响

由表5可知,T4和T3组的红细胞数目和红细胞比容显著高于T2和T1组(P<0.05)。T4组的血红蛋白浓度显著高于其他各组(P<0.05),T3组显著高于T1组(P<0.05)。T4组的平均红细胞血红蛋白含量显著高于T3和T1组(P<0.05),T2和T1组显著高于T3组(P<0.05)。T2组的平均红细胞血红蛋白浓度显著高于T3和T1组(P<0.05),T1、T4组显著高于T3组(P<0.05)。T1组的红细胞分布宽度变异系数显著高于T3组(P<0.05)。T1和T3组的血小板数目显著高于T2和T4组(P<0.05),T4组显著高于T2组(P<0.05)。T2和T4组的血小板比容显著低于T1和T3组(P<0.05)。各组间的平均红细胞体积、平均血小板体积和血小板分布宽度无显著差异(P>0.05)。

2.5 不同铁源对草鱼肝脏组织结构的影响

由图1可见,T1组肝脏切片出现空泡,部分细胞膜边界模糊,细胞核偏移,T2、T3和T4组细胞完整,细胞排列紧密,分布均匀的细胞间边界明显,细胞核明显且位于细胞中央。T1、T2、T3和T4组肝血窦中均含有大量清晰可见的红细胞。

3 讨 论

表5 饲喂添加不同铁源饲料8周的草鱼的血常规指标

T3组的全鱼铁元素含量显著高于T2组,T4组的全鱼铁元素含量有高于T2组的趋势,这表明氨基酸螯合铁比无机铁更容易被鱼体吸收。这可能是因为无机盐形式的铁在鱼的碱性中肠环境下溶解度较低,且铁离子需要在辅酶的参与下和肠道内的蛋白质或氨基酸结合形成络合物,才能被鱼体吸收利用,而氨基酸螯合物可直接被机体吸收[5,32]。郭鑫伟等[5]在珍珠龙胆石斑鱼的研究中发现,相比于硫酸亚铁,羟基蛋氨酸鳌合铁和甘氨酸亚铁更有利于鱼体对铁的蓄积。王二龙[18]报道,随着饲料铁元素含量的升高,斜带石斑鱼全鱼和肝脏铁元素含量呈先上升后平稳趋势。本研究结果显示,T1组的全鱼铁元素含量显著低于T2、T3和T4组。这都说明适量的硫酸亚铁和蛋氨酸螯合铁对鱼体的铁蓄积有着一定的积极影响。

N:细胞核 nucleus;R:红细胞 red blood cells;VS:空泡 vacuoles;SN:偏移的细胞核 shifted nucleus。

血清生化指标和血常规指标是评估鱼类健康的主要参考指标[33]。血液中AST和ALT的活性是评定肝脏功能的关键指标,其活性受到机体营养状况、生长阶段和健康的影响[34]。本试验结果表明,T2、T3和T4组草鱼的血清AST活性显著低于T1组,说明在饲料中添加一定量的铁元素有利于草鱼肝脏健康;而T3组的血清AST活性又显著低于T2、T4组,说明蛋氨酸螯合铁比硫酸亚铁更有利于草鱼肝脏健康,肝脏组织学观察结果也与此相符。血液中GLU的含量是判断动物机体能量代谢的重要指标,能够体现机体的营养吸收状况,当机体合成代谢提高时,血液中GLU的含量下降[35]。而本研究显示,各补充铁元素组草鱼的血清GLU含量均显著低于T1组,说明在草鱼饲料中补充适量的外源性铁有利于机体进行合成代谢。血清中ALB和TP的含量与机体免疫功能密切相关[36]。前人研究发现,饲粮中添加甘氨酸络合铁能有效提高肉羊血清中ALB和TP的含量,提高机体的免疫功能和蛋白质的合成[37]。本研究结果表明,饲喂补充蛋氨酸螯合铁饲料的草鱼血清中TP和ALB的含量显著高于T1组,说明有机铁有利于增强草鱼的免疫功能。本试验中,T2和T3组的血清TCHO含量显著高于T1组,有研究表明血清中TCHO、TG含量与血清铁元素含量均呈正相关关系[38],说明饲料中补充一定量的铁元素可能导致血清铁元素含量升高,从而导致血清TCHO、TG含量升高。ALP是巨噬细胞溶酶体的标志酶,对鱼类机体非特异性免疫至关重要,其活性是反映鱼类非特异性免疫能力强弱的重要指标[39]。本研究中T2和T3组草鱼血清中ALP的活性显著高于T1组,说明饲料中补充一定量的无机铁或有机铁可能会增强草鱼的非特异性免疫功能。

饲料中添加适量的铁可以提高机体红细胞数目和血红蛋白浓度,减少水产经济动物贫血症的发生率,从而提升水产动物的生产效率,增加养殖效益[18]。Gatlin等[40]用精制饲料研究斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)对铁的需求量时发现,饲料缺铁导致斑点叉尾的增重率、血细胞比容、血红蛋白浓度、转铁蛋白氧饱和度和红细胞数目下降。苏传福等[27]对草鱼的研究显示,随着纯化饲料中铁元素含量的添加,草鱼血红蛋白浓度和红细胞数目呈现先上升后下降的趋势。而本研究中T4和T3组的红细胞数目、血红蛋白浓度、红细胞比容都显著高于T1组,T2组的红细胞数目、血红蛋白浓度、红细胞比容与T1组虽无显著差异,但在数值上也均高于T1组。除此之外,本试验中T4和T3组的红细胞数目、血红蛋白浓度、红细胞比容均高于T2组,说明饲料中氨基酸螯合铁的添加可以改善草鱼血红蛋白和红细胞的生成,有效调节机体血液循环[41]。综上所述,饲料中补充适量的铁元素可以提高草鱼的血液健康水平,且以蛋氨酸螯合铁的效果更佳。

4 结 论

综上所述,在本试验条件下,在实用膨化饲料中补充112 mg/kg(以铁元素计)蛋氨酸螯合铁或硫酸亚铁都有利于草鱼健康,其中蛋氨酸螯合铁更有利于草鱼对铁元素的利用,明显提升血液健康水平,从而提高草鱼的生长性能和健康水平。