基于荧光光谱和化学计量学方法的百合产地快速溯源技术

方鑫 陈瑶*,2 陈增萍* 唐章奉 俞汝勤

1（湖南大学化学化工学院，化学生物传感与计量学国家重点实验室，长沙 410082）

2（湖南工业大学生命科学与化学学院，生物医用纳米材料与器件湖南省重点实验室，株洲 412007）

百合（别名：番韭、重迈、中庭、百合蒜、蒜脑薯）为百合科植物卷丹（LiliumlamcifoliumThunb）、百合（LiliumbroumiiF.E.Brown var.viridulumBaker）或细叶百合（LiliumpumilumDC.）的干燥肉质鳞叶[1]。现代研究已证实，百合中富含多糖类、生物碱类、甾体皂苷类、黄酮类以及酚类化合物等多种化学成分，具有止咳平喘[2]、抗氧化[3-4]、抗抑郁[5-6]、抗肿瘤[7]、抗真菌[8]、降血糖[8-9]和免疫调节[10-11]等多种药理作用，被广泛用于临床中药配方和中成药。百合喜凉爽、较耐寒，高温地区生长不良，主要分布在北半球温带地区，我国各地均有大量种植。百合品质受生长环境、土质以及气候的影响[12-13]，存在较大的地域差异。秦昆明等[14]的研究表明，不同地区的百合的化学组分含量差异显著，道地百合的质量具有明显的地域性。历代认为品质最佳的道地百合药材为“龙牙百合”，主要集中于河北、山西、河南、陕西、湖北、湖南、江西、安徽、浙江和湖南等地区。随着百合的经济价值逐渐升高，不良商家常以其它产区的百合冒充道地百合牟利，故亟需发展一种操作简单且能快速对百合进行品质鉴定和产地溯源的方法。

目前，已有大量关于百合产地溯源方法的研究报道。Long 等[15]将基于碳点-四甲氧基卟啉纳米复合材料的纳米效应近红外光谱传感器与偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）相结合，实现了不同产地百合的准确识别；李善家等[16]利用同位素比率质谱和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定了兰州4 个主产区的百合样品中3 种稳定同位素（δ13C、δ15N 和δ18O）比率以及K、Mg 和Ca 等16 种矿质元素的含量，并采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）等多元统计方法构建分类模型，实现了百合的产地溯源。李瑞琴等[17]根据原子吸收光谱等仪器所测得的药食兼用百合中矿物元素的含量对百合进行产地溯源。然而，近红外光谱的特异性较差，百合中的活性成分对近红外光谱信号的贡献较低，导致其分类结果的准确率较低；而原子吸收光谱和ICP-MS 等方法需要大型仪器，需消耗乙炔和氩气等气体，并且需经过繁琐的预处理（如消解、过滤等）后才能对固体样品进行分析，因而不适于现场大批量样品的质量监测和控制。与原子吸收光谱和ICP-MS 相比，荧光光谱具有仪器轻便、检测速度快、灵敏度高以及检测成本低等优点，适于现场大批量中药材的质量鉴别和溯源。Chang 等[18]将多路荧光指纹图谱结合化学计量学方法实现了不同地理来源的白术分类；Li 等[19]将激发-发射矩阵荧光光谱法与偏最小二乘判别分析法（Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA）、k-最近邻和随机森林等化学计量学方法相结合实现了白术粉末样品中掺假成分的快速鉴定和定量分析；杨苗等[20]采用荧光光谱检测技术对枸杞子粉末中的维生素B2进行了直接检测分析；穆希琼等[21]基于党参粉末提取液的三维荧光光谱实现了不同商品等级党参粉末的鉴定。百合含有多种内源性荧光物质[22]，为使用荧光光谱法进行百合产地溯源提供了可能。另外，考虑到固体样品荧光光谱检测技术具有无损、绿色环保（不使用有机溶剂）和样品预处理简单等优点，本研究基于固体样品荧光光谱技术发展了一种百合产地快速溯源的方法，为百合产品的质量监控提供了一种新思路。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-7000 荧光分光光度计（日本Hitachi 公司）；FS5 荧光光谱仪（天美（控股）集团有限责任公司）；超声仪（昆山美美超声责任有限公司）；Super Mini Dancer 离心机（生工生物工程股份有限公司）；ZWM 超纯水仪（湖南中沃水务环保科技有限公司）。

《师说》一文推崇师道，强调师者的传道责任，是韩愈传道努力的见证。他所传的“道”是中国独有的哲学概念，是人道，不宜以“the Way”“doctrine”“truth”这类宗教哲学意味浓厚的词汇来诠释。随着中国软实力的提高，许多中国特色的词汇逐渐被西方世界所接受，如Feng Shui（风水）、Xi Dada（习大大）。因此，对于《师说》中有关儒道释义的“道”完全可以直接音译为“Dao”，并将其具体含义加以注释，将这一英译加入世界哲学概念系统中。而对于《师说》中其他“道”义的翻译，应在充分把握原文的基础上，灵活处理，力求达到“信、达、雅”的标准。

无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 实验方法

图3 为训练集百合粉末样本在PLS-DA 前3 个潜变量中的得分散点图，较直观地提供了PLS-DA 对各产地百合样本的分类结果。湖南株洲、龙山和平江的样本较集中，能够被明显区分；江西万载的样本比较分散，并与平江样本存在一定程度的重叠，因此，PLS-DA 模型对平江和万载样本的判别结果的特异性和灵敏度稍差。

百合提取液三维荧光光谱的测量方法与条件 使用F-7000 荧光光谱仪（日本日立公司）检测百合提取液样品的三维荧光谱数据；激发波长范围为200～500 nm，发射波长范围为250～600 nm，波长间隔为2 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm，电压为700 V，扫描速度为12000 nm/min。

表1 百合样品信息Table 1 Information of Lily samples

为了考察利用百合粉末样品荧光光谱进行产地溯源与利用百合提取液荧光光谱进行产地溯源两种方法之间是否存在显著性差异，本研究按如下方法制备百合提取液样品：将25 g 百合粉末样品置于1 mL 60%（V/V）乙醇溶液中，超声30 min 后，再以4000 r/min 离心10 min。取150 μL 上清液，用乙醇溶液稀释10 倍，即得到百合提取液样品。

弹性评分标准[5]：1分，病灶区呈均匀的绿色；2分，病灶区以绿色为主，内及周边可见少许蓝色；3分，病灶区以蓝色为主，伴有少许绿色和红色；4分，病灶区为均匀蓝色。

1.2.2 光谱检测

60 份样品（百合粉末样品或百合提取液样品）被随机分成训练集（40 个样品）、验证集（15 个样品）和预测集（5 个样品）。采用主成分分析-线性判别法（Principal component analysis-linear discriminant analysis，PCA-LDA）[24]和PLS-DA[25-26]在训练集百合样品的荧光光谱和其产地之间构建线性判别模型（即PCA-LDA 和PLS-DA）。在百合固体粉末光谱3 次测量中，模型判别正确次数达到2 次及以上即为结果判别正确。PCA-LDA 和PLS-DA 中的模型参数是基于相应判别模型对验证集样品的判别准确度最优的原则确定。所建立的PCA-LDA 和PLS-DA 判别模型被用于百合样品的荧光光谱数据分析，并以此预测其产地。

其三，研究所一些细节无不体现对传统尊重的优良所风，在大楼二层的走廊悬挂研究所历任所长的大幅照片，并配有生卒年和简历；在图书馆里设有专架陈列研究所资深研究员赠书，并标上赠书者姓名和照片，真是值得我们研究机构学习和访效啊！

百合中富含多糖类、生物碱类、甾体皂苷类、黄酮类以及酚类等多种化学成分，其中存在大量内源性荧光物质，包括芳香性氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等）、黄酮类化合物（芦丁和黄芩苷等）、酚酸类物质（阿魏酸、咖啡酸和3,4-二羟基苯甲醛（原儿茶醛）等）和生物碱类（盐酸小檗碱）等。如图2 所示，4 种产地的百合样品的荧光光谱形状比较相似，如江西万载样本与湖南龙山、平江和株洲样本之间的相似系数分别为0.9601、0.9503 和0.9241，龙山样本与平江、株洲样本之间的相似系数分别为0.9489和0.9374，平江样本与株洲样本之间的相似系数为0.8080。4 种产地两两之间的相关性较大，凭肉眼难以实现百合的品质鉴定及产地溯源，故需借助化学计量学构建模型。然而，百合粉末荧光光谱的强度及最强荧光位置存在明显差异，例如，平江百合样本的最强荧光位置在发射波长340～470 nm 范围内；而龙山和株洲百合样本的最强荧光位置在发射波长400～470 nm 范围内。由于原儿茶酸的荧光发射波长在340 nm 左右，而咖啡酸、阿魏酸和盐酸小檗碱的荧光发射波长均在400 nm 左右[27]，因此可以大致判断平江百合中原儿茶酸等物质的含量较高，而龙山百合和株洲百合则富含咖啡酸、阿魏酸和盐酸小檗碱，并且这些成分在株洲百合中的含量可能高于其在龙山百合中的含量。由此可推断不同产地百合样品中主要荧光物质的种类差异不大，但其含量可能有较大的变化，这为采用荧光光谱对百合样品进行产地溯源奠定了基础。

实地采集60 份分属于4 个产地的百合样品（表1）。使用流水清洗，去除新鲜百合鳞茎样品的表层泥土，然后将百合样品掰成单片，置于100 ℃水中烫片5 min，捞出沥干水分后，于60 ℃条件下热风烘干[23]，粉碎，过80 目（筛孔孔径0.18 mm）筛，所得细粉即可进行固体荧光光谱测试。

图1 为龙山百合样品在不同激发波长下的荧光发射光谱。当激发波长较短（如250 nm）时，百合样本的荧光发射光谱出现多个由固体散射导致的尖锐荧光峰，但是当激发波长增大到280 nm 时，由固体散射导致的尖锐荧光峰基本消失。由于百合样品的荧光发射波长范围为300～600 nm，若继续增大激发波长，百合样品的荧光光谱将会发生强烈的瑞利散射现象，因此本研究设置激发波长为280 nm。

1.2.3 数据分析

定植后至第一穗果坐住之前，不浇水，蹲苗以促根子下扎，当第一穗果有核桃大时，结束蹲苗，开始灌水，每10～15天/次，并结合浇水冲施硝酸钾复合肥，每667平方米10千克。

2 结果与讨论

2.1 百合粉末样品的荧光光谱

对所获得的不同土地利用方式大型土壤动物数据进行整理和统计，并加以分析。土壤动物多度等级划分[16]：某类群个体数量占总捕获量10%以上为优势类群（+++），1%-10%为常见类群（++），＜1%为稀有类群（+）。运用Shannon-Wiener多样性指数（H）、Pielou均匀性指数（J）、Simpon优势度指数（C）、Margalef丰富度指数（D）描述土壤动物群落结构特征。各指数计算公式如下：

图1 不同激发波长下百合粉末样本的荧光发射光谱:（a）250 nm;（b）260 nm;（c）270 nm;（d）280 nmFig.1 Fluorescence emission spectra of lily powder samples measured at different excitation wavelengths:(a) 250 nm;(b) 260 nm;(c) 270 nm;(d) 280 nm

百合固体粉末荧光光谱的测量方法与条件 将百合固体粉末平铺于载玻片的凹槽中，盖上盖玻片，用FS5 荧光光谱仪（天美（控股）集团有限责任公司）检测其荧光发射光谱，同一样本转动角度重复测量3 次；激发波长为280 nm，发射波长范围为300～700 nm；为减少固体散射效应的影响，选用了波长范围为300～700 nm 的滤光片。

图2 不同产地的百合粉末样品的荧光光谱：（a）WZ;（b）LS;（c）PJ;（d）ZZFig.2 Fluorescence spectra of lily powder samples from different habitats: (a) WZ;(b) LS;(c) PJ;(d) ZZ

2.2 基于百合粉末样本荧光光谱的产地溯源分析

本研究利用PCA-LDA 和PLS-DA 两种模式识别方法对不同产地的百合进行分类。PCA-LDA 模型中的主成分数（7）和PLS-DA 模型中的潜变量数（7）通过留一交互验证法确定。如表2 所示，PCA-LDA 和PLS-DA 模型对训练集和验证集的分类准确率（Correct classification rate，CCR）均大于93.3%，除PCALDA 训练集中的江西万载和湖南平江样品外，两个模型对训练集和验证集中其它样品的判别灵敏度均达到100%；无论是训练集还是验证集，两个模型的特异性均达96.7%以上。这些结果说明这两种模型均可较好地正确识别目标类别样本和拒绝其它类别样本。另外，这两个模型对龙山和株洲的百合样本的判别结果在特异性和灵敏度方面明显优于对其它两个产地百合样本的判别结果。

表2 基于百合粉末荧光光谱构建的PCA-LDA和PLS-DA产地溯源模型的预测性能Table 2 Predictive performance of PCA-LDA and PLS-DA models based on fluorescence spectra of lily powder samples

1.2.1 样品来源及前处理

图3 训练集百合粉末样本在PLS-DA 前3 个潜变量中的得分散点图Fig.3 Scatter plot of the scores of lily powder samples in training set on the first three latent variables of PLS-DA

利用PCA-LDA 和PLS-DA 两个模型对百合粉末训练集、验证集和测试集的混淆矩阵（表3）表明，PCA-LDA 将训练集中1 个万载样本错误分到了龙山、1 个平江样本错误分到了江西万载。相比之下，PLS-DA 对训练集样本的分类结果全部正确。导致PCA-LDA 和PLS-DA 模型不易将平江样本与万载样本区分开来的原因可能是：平江和万载虽在地理位置上相距较远，但这两地的百合样本均为龙牙百合，其品种相同，百合品种对其内源性荧光成分含量的影响可能要大于产地对其内源性荧光成分含量的影响。PCA-LDA 和PLS-DA 模型对由5 个平江百合样本构成的测试集的预测结果表明，这两种模型均能对未知百合样本的产地进行有效识别。综上，PLS-DA 模型的预测性能略优于PCA-LDA 模型。

表3 PCA-LDA与PLS-DA对百合粉末训练集、验证集和测试集的混淆矩阵Table 3 Confusion matrices of PCA-LDA and PLS-DA models for training set,validation set and test set of lily powder samples

2.3 基于百合提取液样品荧光光谱的产地溯源分析

为了消除轻微的拉曼散射影响，测量了3 个空白样本（60%（V/V）乙醇溶液）的三维荧光谱数据矩阵，并将其平均值从每个样本的三维荧光谱数据矩阵中扣除。最后采用Bahram 等[28]提出的插值法扣除了每个样本的三维荧光谱数据矩阵中的瑞利散射（图4）。

进一步丰富农业物质产业，促使其向着多元化方向发展，促使乡村旅游具有丰富的观光特色，促使乡村旅游气氛更加活跃。将乡村种植经济进行转型，使其发展成第一、二、三产业模式，对这些产品进行统一加工，借助消费者旅游口碑，对农产品进行进一步推广[5]。

图4 百合提取液的三维荧光光谱数据：（A）原始光谱数据；（B）扣除瑞利散射后的光谱数据；（C）使用插值法拟合后的光谱数据Fig.4 Three dimensional fluorescence spectral data of lily extracts:(A)Original spectral data;(B)Spectral data after deducting Rayleigh scattering;(C) Spectral data after fitting with interpolation method

如图5 所示，4 种不同产地的百合提取液样品的三维荧光光谱之间存在明显差异。由此可推断，基于百合提取液样品的三维荧光光谱所提供的信息可用于百合的产地溯源。

图5 不同产地百合提取液样品扣除瑞利散射后的三维荧光数据图：（A）WZ；（B）LS；（C）PJ；（D）ZZFig.5 Three dimensioanl fluorescence spectral data of lily extracts from different habitats after dudction of Rayleigh scattering: (A) WZ;(B) LS;(C) PJ;(D) ZZ

基于百合提取液样品三维荧光光谱构建的PCA-LDA（9 个主成分）和PLS-DA（9 个潜变量）产地溯源模型的预测性能见表4。PCA-LDA 和PLS-DA 模型采用的主成分数和潜变量数通过留一交互验证方法确定。PCA-LDA 对训练集的CCR、特异性和灵敏度分别为97.5%、97.1%～100%和94.4%～100%，对验证集的相应预测性能指标却均达到了100%。PLS-DA 对训练集的相应预测性能指标均达到了100%，对验证集的预测性能有所下降，但其CCR、特异性和灵敏度也均高于83.3%。这两种模型对平江百合样本的判别灵敏度稍低于对其它产地百合样品的判别灵敏度。由表5 可知，PCA-LDA 模型将训练集中1 个平江样本错误判别为龙山样本，而PLS-DA 将验证集中的一个平江样本错误判别为株洲样本，两个模型对所有测试样本的产地均进行了正确的判别。这些结果验证了采用百合提取液样品的三维荧光光谱对百合进行品质鉴定、产地溯源的可行性与可靠性。

表4 基于百合提取液样本三维荧光光谱构建的PCA-LDA和PLS-DA产地溯源模型的预测性能Table 4 Predictive performances of PCA-LDA and PLS-DA origin traceability models based on three dimensional fluorescence spectra of lily extracts

表5 PCA-LDA与PLS-DA对百合提取液训练集、验证集和测试集的混淆矩阵Table 5 Confusion matrix of PCA-LDA and PLS-DA for training set,validation set and test set of lily extracts

3 结论

探究了基于百合粉末荧光光谱与化学计量学相结合的百合产地溯源方法的可行性和可靠性，结果表明，基于百合粉末荧光光谱构建的判别模型能够对不同产地的百合样本进行准确的溯源分析。其中，PCA-LDA 对训练集和测试集的CCR 分别为93.6%和95.6%，PLS-DA 的相应值分别为98.3%和93.3%。另外，基于百合粉末荧光光谱构建的判别模型的预测能力与基于百合提取液三维荧光光谱构建的判别模型的预测能力基本一致。然而，获取百合提取液的三维荧光光谱需要经过超声提取和离心分离等较繁琐的样品处理步骤，所需检测时间长，并且需要消耗有机溶剂，不适合现场大批量样品的检测。基于百合粉末荧光光谱的产地溯源方法具有样品预处理简单（只需粉碎样本）和无需使用任何有机溶剂的优点，因此更适于现场大批量样品的检测。与传统方法相比，基于百合粉末荧光光谱和化学计量学相结合的百合产地溯源方法具有灵敏度高、操作简单、检测速度快、成本低和绿色环保等优点，为百合的产地溯源提供了一种新思路，能有效防止百合市场上出现以次充好的现象，有利于维护百合市场的秩序和消费者权益。