解整合素-金属蛋白酶33基因多态性与胆管癌及血清肿瘤标志物水平的相关性研究

邱 雷,危贵君

邱雷,危贵君,湖州市第一人民医院消化内科 浙江省湖州市 313000

0 引言

胆管癌(cholangiocarcinoma,CC)是发源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,根据病灶的解剖部位可分为肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝外胆管癌.ICC的恶性程度较高,发病隐匿,约占胆管癌的十分之一,患者预后差[1].目前认为其发病与肝炎、糖尿病、吸烟、饮酒、基因多态性、肥胖等多种因素有关.由于CC临床症状不典型,早期发现较为困难,且病情发展迅速,尚缺乏有效根治手段,手术、放疗及化疗等常规抗肿瘤的远期疗效不佳,易导致术后的复发及转移,预后较差[2,3].因此,寻找新的诊疗手段具有重要临床意义.

解整合素-金属蛋白酶(disintegrin and metalloproteinase,ADAM)33为ADAM家族的一员[4],能够通过其所拥有的解体蛋白及金属蛋白酶结构域加速细胞-细胞-基质之间的相互作用,在肿瘤、炎症的发生发展中发挥重要作用[5,6].张国华等[7]研究显示,胆管癌组织中ADAM33蛋白表达显著升高,且与预后不良有关.马兰红等[8]研究发现携带ADAM33 rs678881GC、CC基因型的支气管哮喘患儿血浆白细胞介素-4、免疫球蛋白E水平较高而γ-干扰素水平较低,且消化道反应的发生率高,ADAM33 rs678881GC、CC基因型可能参与了儿童支气管哮喘的发展.故本研究观察了CC患者肿瘤组织中ADAM33 rs678881及rs2853209基因SNP的表达水平并分析ADAM33 rs678881及rs2853209与CC的易感性.

1 材料和方法

1.1 材料 选取2017-01/2020-06期间于我院诊治的胆管癌手术患者212例作为研究组,其中男性109例、女性103例,年龄(65.2±16.4)岁;肿瘤部位:肝内胆管癌患者114例,肝外胆管癌患者98例;分化程度:高、中、低分化者分别为17例、139例及56例;有淋巴结转移者136例;术后1年复发或出现进展者71例;临床分期:Ⅰ/Ⅱ期73例,Ⅲ/Ⅳ期139例.纳入标准:(1)所有患者均行胆管癌切除手术,且术后均经病理组织学确诊为胆管癌;(2)术前均未进行抗肿瘤治疗;(3)临床资料完整.以同期在我院体检的健康查体者186例作为对照组,患者均无合并免疫性疾病、无严重心肺肝肾疾病.其中,男性97例、女性89例,年龄(63.3±17.5)岁.两组病例的性别、年龄基线资料比较无差异,具有可比性.本研究已获得本院医学伦理委员会审批.

1.2 方法

1.2.1 基因序列的SNP检测:患者入院后即抽取空腹肘部静脉血,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)法进行SNP的检测.采用贝克曼公司生产的基因组DNA提取试剂盒进行外周血DNA提取,严格按照试剂盒说明书进行操作,鉴定DNA的浓度及纯度并采用核酸电泳检测序列的完整性,进行PCR反应,ADAM33 rs678881上游引物5′-TTCAAAGCCTCCCCCTCTCATC-5′,下游引物5′-TGATCCAGGAAAAGCCACAGC-3′;ADAM33 rs2853209上游引物5′-AGGGTGAGGCAGCCAGCT-3′,下游引物5′-CTTCCTCAGTGGCCTCCCAGTCAATCG-3′,引物由上海宝成生物技术有限公司合成.PCR总反应体系25 μL.PCR反应条件:95 ℃下预变性3 min,94 ℃变性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃下延伸30 s,72 ℃延伸7 min,共45个循环.取8 μLPCR产物,加入2 U限制性核酸内切酶I(restriction endonuclease Ⅰ,EcoR Ⅰ),用双蒸水补足总反应体系至10 μL,37 ℃水浴4 h,进行酶切反应,反应结束后进行凝胶电泳并鉴定基因型.

1.2.2 肿瘤标志物的检测:患者入院后即抽取空腹肘部静脉血4 m L.采用酶联免疫吸附法检测血清sICAM-1水平,电化学发光法检测血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、癌细胞表面抗原(cancer cell surface antigen,CA19-9)水平.

统计学处理采用SPSS 22.0软件进行数据的分析及计算,计量资料以mean±SD表示,采用单因素方差分析;不同基因型之间变异发生率的比较χ2检验,均值比较采用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 ADAM33 rs678881、rs2853209与胆管癌易感性的相关关系 研究组ADAM33 rs678881 GC、CC的基因分布频率显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),提示携带ADAM33 rs678881GC、CC基因型的人群更易发生胆管癌.研究组ADAM33 rs678881C等位基因分布频率显著高于对照组(P＜0.05).两组ADAM33 rs2853209各基因型及等位基因分布频率比较,差异均无统计学意义.提示携带ADAM33 rs678881 C等位基因型的人群更易发生胆管癌.见表1.

表1 ADAM33基因rs678881、rs2853209与胆管癌易感性的相关关系[n(%)]

2.2 两组肿瘤标志物水平比较 研究组患者CA19-9、sICAM-1及CEA水平显著高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05),提示胆管癌患者血清CA19-9、sICAM-1及CEA等肿瘤标志物水平显著增高.见表2.

表2 两组CA19-9、sICAM-1及CEA水平的比较(mean±SD)

2.3 研究组各基因型患者CA19-9、sICAM-1及CEA水平比较 ADAM33 rs678881GG、GC、CC基因型患者的CA19-9、sICAM-1及CEA水平依次升高,各基因型之间水平比较差异具有统计学意义(P＜0.05).rs2853209患者的CA19-9、sICAM-1及CEA水平各基因型之间比较,差异均无统计学意义.在ADAM33 rs678881患者中,不同基因型患者的血清肿瘤标志物水平不同,尤以CC基因型患者的水平最高.见表3.

表3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型胆管癌患者患儿的CA19-9、sICAM-1及CEA水平比较(mean±SD)

2.4 研究组各基因型患者单核苷酸多态性与胆管癌临床病理关系 根据ADAM33基因rs678881、rs2853209与胆管癌易感性的关系研究发现,携ADAM33 rs678881 C等位基因型的人群更易发生胆管癌,因此将ADAM33 rs678881位点的GC和CC基因型合并,来比较GC/CC基因型、CC基因型与胆管癌临床病理的关系.在212例胆管癌患者中,GC/CC基因型在性别、年龄分层、肿瘤部位、分化程度、方面的发病频率比较,差异无统计学意义.在临床TNM分期Ⅰ/Ⅱ型患者中GC/CC基因型频率显著低于Ⅲ/Ⅳ期患者,差异具有统计学意义(P＜0.05).在有淋巴结转移的患者组中GC/CC基因型频率显著高于无淋巴结转移患者,差异具有统计学意义(P＜0.05).在有复发或进展的患者组中GC/CC基因型频率显著高于无复发或无进展患者,差异具有统计学意义(P＜0.05).提示ADAM33基因rs678881位点GC/CC基因型可能是胆管癌发病的危险因素,与胆管癌的淋巴结转移、复发或进展和临床 NM分期晚关系密切.见表4.

表4 ADAM33基因rs678881与胆管癌临床病理的相关关系[n(%)]

2.5 ADAM33基因rs678881多态性与胆管癌预后的关系 所有患者均连续3年,失访5例,失访率为2.35%.其中,GC/CC基因型患者中位生存时间为17.6 mo,3年生存率为21.7%;而GG基因型患者中位生存时间为23 mo,3年生存率为33.0%.GC/CC基因型患者的中位生存时间及3年生存率均显著低于GG基因型患者.提示ADAM33基因rs678881GC/CC基因型可作为判断胆管癌雨后的重要指标.

3 讨论

CC多为源自胆管黏膜上皮细胞的恶性肿瘤,治疗仍以外科手术为主[9,10],由于早期临床症状不典型,往往易漏诊,由于手术根治率不高,术后缺乏有效治疗药物,5年生存率不足30%.因此,探索胆管癌的发病机制,寻找早期有效的治疗药物十分重要.

ADAM33基因是新近研究较多基因,研究发现其与支气管哮喘发生发展有关,可能是易感基因[11],其存在特殊的结构域,包括信号肽、金属蛋白酶、解整合素等,性质较为保守,通过其变化能够参与各种信号途径的转导.研究表明[12,13],ADAMs家族蛋白与肿瘤细胞的侵袭及转移过程密切相关,可能是导致肿瘤复发及转移的重要因素.有研究发现[14],ADAM33在胃癌组织中表达升高,能够促进胃癌细胞的增殖及迁移.张国华等[7]研究发现,胆管癌组织中ADAM33蛋白表达上调,且与预后不良有关,但ADAM33基因的单核苷酸多态性与胆管癌发病的相关性尚未见报道.

本研究结果显示,研究组的ADAM33 rs678881 GC、CC的基因分布频率显著高于对照,提示携带ADAM33 rs678881GC、CC基因型的人群更易发生胆管癌.研究组的ADAM33 rs678881C等位基因分布频率显著高于对照组,提示携带ADAM33 rs678881C等位基因型的人群更易发生胆管癌.而两组ADAM33 rs2853209各基因型及等位基因分布频率比较,差异均无统计学意义.提示ADAM33 rs2853209与胆管癌的发病相关性较小.

同时,本研究还发现,ADAM33 rs678881GG、GC、CC基因型患者的CA19-9、sICAM-1及CEA水平依次升高,各基因型之间水平比较差异具有统计学意义.表明ADAM33基因rs678881的单核苷酸多态性能够反映胆管癌的恶性程度,其可能参与了胆管癌的发展.

将含C等位基因和不含C等位基因分成两组,研究不同基因型组与胆管癌临床病理的关系,结果显示,在 212例胆管癌患者中,GC/CC基因型和GG两组基因型在不同年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度组间分布中比较,差异无显著性.但GC/CC基因型频率在有淋巴结转移、TNM Ⅲ/Ⅳ期、有复发或进展组明显高于无淋巴结转移、TNM Ⅰ/Ⅱ期、无复发或进展组,差异具有统计学意义.提示GC/CC基因型可能与胆管癌的浸润和转移相关.

在为期3年的随访期中,GC/CC基因型患者3年生存率低于GG基因型患者,说明AG/GG基因型可能时预测胆管癌预后的重要因素.

4 结论

综上所述,ADAM33 rs678881GC、CC基因型及C等位基因与胆管癌的发病密切相关,可能是易感基因,而rs2853209基因多态性可能与胆管癌的易感性无关.但由于本研究样本量较小,研究时间较短,并未进一步研究不同类型胆管癌中基因型的分布差异,在下一步的研究中将加以验证.

文章亮点

实验背景

胆管癌(cholangiocarcinoma,CC)是临床常见的恶性肿瘤之一,其临床症状不典型,往往预后较差.胆管癌组织中(disintegrin and metalloproteinase,ADAM)33蛋白表达显著升高,可能是导致CC预后不良的一个重要因素,但其基因多态性与CC发病的相关关系研究相对较少.

实验动机

本研究试图探讨遗传因素之基因多态性对与CC病情进展及预后之间的联系,为CC患者的诊断及更有效治疗提供基因分型的依据.

实验目标

本研究旨在通过对ADAM33基因进行分型,分析ADAM33基因多态性与胆管癌及血清肿瘤标志物水平的相关性,从而确定不同基因型的患者对CC的易感性,为CC患者的诊断及治疗提供借鉴和依据.

实验方法

本研究主要采用数据分析的方法,分析CC患者ADAM33基因多态性与胆管癌及血清肿瘤标志物水平的相关性,统计并分析ADAM33基因型与CC患者临床病理及预后的关系,从而阐述ADAM33基因型对CC患者易感性的影响.

实验结果

研究组的ADAM33 rs678881 GC及rs678881 CC的基因分布频率较对照组高.研究组的ADAM33 rs678881C等位基因分布频率较对照组高.GC/CC基因型频率在有淋巴结转移、TNM Ⅲ/Ⅳ期、有复发或进展组明显高于无淋巴结转移、TNMⅠ/Ⅱ期、无复发或进展组.

实验结论

ADAM33 rs678881GC、CC基因型及C等位基因与CC的发病密切相关,可能是易感基因,参与了CC的病程进展.

展望前景

本研究随访时间相对较短,病例数较少,且为单中心研究,对于ADAM33引起CC的分子机制不明确.下一步将对这些患者做进一步的跟踪随访,分析在更长的时间段内ADAM33与CC复发的关系及具体作用机制.