基于网络药理学的中药防治缺血性脑卒中的研究进展

刘跃 王佳乐 黄文韬 赵程龙 冯琦 于文霞 翟凤国

脑卒中又称中风，分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，在临床上绝大部分的脑卒中属于缺血性脑卒中。近年来缺血性脑卒中在我国的发病率呈逐年上升趋势[1]，且发病群体逐渐趋于年轻化，当代年轻人的生活压力是该疾病的主要诱发因素之一。研究发现，中药能够防治缺血性脑卒中，具有疗效好、不良反应少等优势[2]，但因中药成分繁多、作用机制复杂，故很难准确定位其有效成分和治疗靶点，而网络药理学可以预测中药有效成分对疾病靶点及通路的影响，因此可用来辅助筛选防治缺血性脑卒中的中药及其有效成分，定位疾病关键治疗靶点。

早在1999 年，我国李梢[3]就提出了中药与生物分子网络之间互相关联的假说。在2007 年，英国药理学家Hopkins[4]首次提出“网络药理学”一词。2011 年李梢[5]又提出了“网络靶标”这一名词，并指出网络药理学的核心就是“网络靶标”。通过网络药理学可以实现“中药-成分-靶点-疾病”的网络构图，以“网络”为核心，运用大量的数据库和生物信息技术手段，筛选药物的有效成分和疾病的靶点信息，经过VENNY 线上平台筛选出两者的交叉靶点，使用Cytoscape 软件构建“中药有效成分-靶点-疾病”网络图，进行基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）富集分析，筛选潜在的相关靶点和作用通路[6]。基于以上研究背景，我们将重点概述网络药理学在单味中药以及复方中药防治缺血性脑卒中的研究进展。

1 网络药理学在单味中药防治缺血性脑卒中的应用

1.1 栀子

1.1.1 中药有效成分研究 孙瑜等[7]使用中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP 数据库）检索“栀子（Gardenia jasminoides Ellis）”，并设置类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，筛选出17 个有效活性成分。使用Cytoscape 软件构建有效成分-缺血性脑卒中疾病靶点网络图，共获得94 个节点，237 个关系，经拓扑分析后得出栀子中共有12 个核心有效成分可用于治疗缺血性脑卒中，其中包括槲皮素、山奈酚和栀子苷等有效成分。赵唯宇等[8]在实验研究中证明，槲皮素可通过抑制炎症因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）改善小鼠脑卒中的程度。郑红丽等[9]研究发现，山奈酚通过抗氧化、抗炎、抑制凋亡三种途径对缺血性脑卒中的神经元发挥保护作用。研究表明栀子苷也可有效治疗心脑血管疾病[10]，吴杰[11]在实验中证明，黄芪苷与栀子苷联用可以保护损伤的神经元细胞，也可通过抑制小胶质细胞的M2 极化间接保护神经元细胞。此外，丁嵩涛等[12]实验研究表明，栀子苷通过调节细胞内的一氧化氮合酶（NOS）活性，促进NO 生成的正常水平，并表现出抗凋亡的作用，保护血管内皮细胞，从而起到预防脑卒中的效果。

1.1.2 有效成分靶点与疾病靶点研究 孙瑜等[7]通过检索大量的疾病数据库得到4 409 个缺血性脑卒中的相关靶点，经Venny2.1 绘图工具绘制韦恩图可知栀子中潜在的活性成分靶点与缺血性脑卒中相关的靶点有80 个。在PPI 网络图中，按照degree 值排序，前6 位的靶点为血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、G1/S-特异性周期蛋白D1（cyclin D1）、MYC 基因、胱天蛋白酶3（Caspase3，CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、表皮生长因子受体（Epithe-lial growth factor receptor，EGFR）。VEGFA 具有促进新生血管的形成及增加血管通透性的作用，王富明[13]在实验研究中发现，药物和针刺治疗可通过下调VEGFA 的表达而改善大鼠脑部缺血、缺氧造成的损伤。

1.1.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析 孙瑜等[7]通过Metascape 平台进行GO 功能分析得出，栀子防治缺血性脑卒中时涉及细胞对激素的反应、对酮的反应以及凋亡信号通路等，其主要功能为转录因子结合、激酶结合等生物学过程，参与这些过程的细胞组分有膜筏、转录因子复合物等；KEGG 富集分析结果表明栀子治疗缺血性脑卒中的通路主要有核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）、血小板活化、液体剪切力、MAPK 信号通路、动脉粥样硬化，其中NF-κB 是一种蛋白复合物，其控制转录的DNA、细胞因子产生和细胞存活。杨华等[14]实验研究证明，丹参酮ⅡA 通过降低NF-κB 表达而减轻大鼠脑微血管内皮细胞的炎症损伤；冯曼莎等[15]研究显示，降低血小板的活化率和黏附率可使大脑中动脉血液流量增加，改善大脑微循环，对脑组织有保护作用；孙飞一等[16]通过患者的调查、资料的整理以及图像与数据的分析得出，动脉粥样硬化斑块是缺血性脑卒中的危险因素之一，预防斑块的形成也是预防该疾病的一种有效途径。

栀子中的有效成分可以通过抗氧化、抗炎、抑制凋亡三种途径防治缺血性脑卒中；通过构建“中药有效成分-靶点-疾病”网络，发现栀子有效成分可通过VEGFA 减轻脑缺血再灌注损伤，血小板活化率、动脉粥样硬化程度和NF-κB 信号通路与缺血性脑卒中有关。

1.2 漏芦

1.2.1 中药有效成分研究 李媛媛等[17]使用TCMSP数据库检索“漏芦（Rhaponticum uniflorum（L.）DC.）”，并设置DL ≥0.18、OB ≥30%，筛选出5 种有效活性成分，包括β-谷甾醇、甘草素、谷甾醇、甘草苷、黄独素B。陈元堃等[18]研究指出，β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化以及对中枢神经系统有一定的保护作用。Choi 等[19]在研究中发现β-谷甾醇可以使蒙古沙鼠受损伤的脑血管再生，令沙鼠恢复一定的运动能力。

1.2.2 有效成分靶点与疾病靶点研究 李媛媛等[17]以“ischemic stroke”为检索词在疾病数据库中检索，获得1 026 个与缺血性脑卒中相关的靶点信息，漏芦活性成分的相关靶点信息有375 个，经过VENNY 线上平台筛选出118 个漏芦可以防治缺血性脑卒中的靶点。在PPI 网络图中，degree 值排行前5 位的靶点为白蛋白（Albumin，ALB）、IL-6、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、CASP3、MAPK1。Zhang 等[20]研究指出，低ALB 血症的患者脑卒中发生率高于常人，ALB 通过抑制血小板活化，改善脑血管微循环，从而达到神经保护作用。TNF、IL-6都是强有力的促炎因子，可以直接参与炎症反应过程，加重脑组织损伤。肖东芳等[21]研究表明，IL-6和TNF-α 水平与缺血性脑卒中的严重程度成正比。

1.2.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析 李媛媛等[17]通过DAVID 数据库进行GO 功能分析，依据P<0.05选取相关生物过程。GO 分析集中细胞生物过程包括一氧化氮生物合成过程的正向调控、药物的反应等。与细胞组成相关的条目有30 个，主要包括细胞外间隙、细胞质等。涉及分子功能的靶点包括酶结合、蛋白结合等。KEGG 分析显示，漏芦治疗缺血性脑卒中的通路主要有TNF 信号通路、低氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）信号通路。HIF-1 有两个亚型即HIF-1α 和HIF-1β。有研究指出，当细胞轻度缺氧时，HIF-1 会抑制细胞凋亡，保护细胞存活，当细胞长时间处于缺氧状态，HIF-1 会诱导细胞凋亡，从而保护正常细胞[22]。TLR 家族中成员众多，其亚型TLR4 对缺血性脑卒中的炎症反应起到调控作用。黎艳等[23]的实验表明，通过给大鼠灌胃薯蓣皂苷元，可以下调TLR4，使TNF-α 和IL-6 的水平降低，从而抑制脑组织炎症反应的进展，保护受损的脑神经。

β-谷甾醇可有效防治缺血性脑卒中。ALB、TNF、IL-6 的表达在缺血性脑卒中发挥重要作用，构建“中药有效成分-靶点-疾病”网络，发现TLR4 信号通路可通过调控TNF-α、IL-6 的表达，对脑缺血的神经起到保护作用。网络药理学在单味药防治缺血性脑卒中的应用见表1。

表1 网络药理学在单味中药防治缺血性脑卒中的应用

2 网络药理学在复方中药防治缺血性脑卒中的应用

2.1 黄芪-川芎

2.1.1 中药有效成分研究 陈红阳等[24]通过TCMSP数据库对“黄芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge）”和“川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）”进行有效成分检索，设置条件OB ≥30%、DL ≥0.18、Caco-2 ≥-0.4、血脑屏障（BBB）≥-0.3、HL ≥4h，筛选后得到黄芪11 个有效活性成分，包括黄芪甲苷、丁子香萜、栀子醇、联苯双酯等。川芎6 个有效活性成分包括谷甾醇、杨梅酮、川芎嗪等。Li 等[25]研究发现，黄芪甲苷可以抑制信号转导及转录激活蛋白3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的表达，从而抑制小鼠脑缺血急性期NK细胞的活化，对急性脑缺血损伤有保护作用。于迎春等[26]通过网络药理学的手段说明了川芎嗪治疗缺血性脑卒中的分子机制。在网络药理学的理论基础上同时有动物实验证实了川芎嗪对脑缺血的神经具有保护作用[27]。

2.1.2 有效成分靶点与疾病靶点研究 陈红阳等[24]研究发现，黄芪、川芎治疗缺血性脑卒中的潜在靶点有97 个。通过检索OMIM、TDD 等疾病数据，检索出393 个治疗该疾病的相关靶点。将这两类靶点进行对比，筛选出18 个共同靶点。构建PPI 蛋白网络，其中节点连接的边数越多表示在该疾病中越重要。其中较重要的蛋白靶点包括血管生成素1（Angiopoietins 1，ANGPT1）、CASP3、NOS3、IL-6、TNF、IL-10、IL-1β 等。内皮细胞NOS3 是NOS 的一种亚型，NOS3 的多肽位点可使其表达下调从而减少NO 的生成。朱殊等[28]研究发现，NOS3 与缺血性脑卒中的发病有关，并且TT 型基因患病风险高于GG 型基因。ANGPT1 在大脑中的星形胶质细胞中表达，ANGPT1 的血管再生及抗炎作用可能有助于保护缺血后的脑神经。Du 等[29]研究表明，ANGPT1 通过与内皮细胞密切接触的星形胶质细胞调节缺血性脑卒中的神经损伤。

2.1.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析 有研究[23]对治疗缺血性脑卒中的潜在靶点进行GO 富集分析，主要涉及NOS 活性调节、蛋白激酶B 信号的正调控、VEGF 的正调控等生物过程。参与的细胞组成主要包括细胞外间隙、质膜等。涉及的分子功能主要包括细胞因子活性、生长因子活性等。KEGG通路富集分析结果显示，黄芪-川芎治疗缺血性脑卒中参与的通路主要包括HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、磷脂酰肌醇3 激酶B（Phosphati.dylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶（Protein kinase B，AKT）信号通路、NOD 样受体（NLR）信号通路、NF-κB信号通路、Tie 信号通路等。其中，血管生成素-1（Ang-1）和酪氨酸激酶受体-2（Tie-2）是近些年发现的一种介导血管生长的信号通路，主要表达于内皮细胞和造血细胞。刘婷婷等[30]建立局灶性脑缺血大鼠模型后给予模型鼠莫诺苷，发现Ang-1 和Tie-2 水平均有升高的趋势，改善了脑部血管的微循环，在一定程度上保护缺血后脑部损伤的神经。此外，张涓等[31]研究显示，Ang-1 和Tie-2 的表达上调可以促进血管的新生和神经再生。

黄芪甲苷和川芎嗪从不同程度上预防缺血性脑卒中；NOS3 与缺血性脑卒中的发病具有相关性；ANGPT1 在大脑中的表达可以调节缺血性脑卒中导致的神经损伤；Ang-1/Tie-2 信号通路可促进脑部血管新生，从而治疗缺血性脑卒中。

2.2 丹参-红花

2.2.1 中药有效成分研究 朱慧渊等[32]利用TCMSP数据库，分别以“丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）”、“红花（Carthamus tinctorius L.）”为检索词进行检索，设置条件OB ≥30%、DL ≥0.18，筛选得到红花22个有效活性成分、丹参65 个有效活性成分，主要包括豆甾醇、黄芩苷、木犀草素、山柰酚、槲皮素等。Sun 等[33]研究发现豆甾醇对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，其机制是通过磷酸腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路增强内源性抗氧化防御系统，抑制自噬激活。焦红蕾[34]实验表明，山奈酚激活Wnt/β-连环蛋白信号通路使神经生长因子上调，达到保护脑部神经的效果。

2.2.2 有效成分靶点与疾病靶点研究 朱慧渊等[32]通过疾病数据库检索出1 287 个治疗缺血性脑卒中的相关靶点，丹参、红花治疗该疾病的潜在靶点有253 个，通过VENNY 线上平台筛选出161 个交集靶点。构建PPI 蛋白网络，其中较为重要的靶点为CASP3、IL-6、TNF 等。Liu 等[35]研究表明，通过降低CASP3 诱导的组蛋白脱乙酰酶4（HDAC4）降解，可使少量HDAC4 在核内积聚，增加肌细胞增强因子2A（MEF2A）转录水平，促进下游蛋白B 淋巴细胞瘤-xl（Bcl-xl）的表达，抑制细胞凋亡，对缺血性脑损伤具有保护作用。

2.2.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析 朱慧渊等[32]使用DAVID 数据库对治疗该疾病的潜在靶点GO富集分析得出，主要的生物学过程包括RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、DNA 转录和调控、基因表达的正调控等。KEGG 通路富集分析结果显示，涉及的信号通路主要包括PI3K/AKT、TNF、HIF-1、NF-κB 等。PI3K/AKT 信号通路由PI3K 和下游的AKT 组成。脑缺血发生后，机体释放神经细胞生长因子、整合素等，使PI3K、AKT 磷酸化，激活PI3K/AKT 信号通路，从而激活凋亡基因发挥抗凋亡作用[36]。Zhang 等[37]研究发现SRY-box 转录因子5 在转录上调控VEGF，能与细胞膜上的血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合，激活PI3K/AKT 信号通路，逆转缺血性脑卒中引起的神经损伤。

豆甾醇和山奈酚可通过不同机制保护脑部神经，通过下调CASP3 的表达，保护大脑皮质受损神经；PI3K/AKT 信号通路可激活凋亡基因保护脑神经；SRY-box 转录因子5 与VEGFR 结合进而激活PI3K/AKT 信号通路保护脑神经损伤，该通路是防治缺血性脑卒中的一条重要途径。网络药理学在复方中药防治缺血性脑卒中的应用见表2。

表2 网络药理学在复方中药防治缺血性脑卒中的应用

3 结论

我国中药有着几千年的悠久历史，是发现多靶点药物的源泉。网络药理学的研究策略符合中医药对疾病整体的认识，不仅有利于发现中药配伍之间的内在联系，还为中医药的创新发展提供依据。

目前网络药理学已渗入到医药学领域的多个方面，体现了从传统模式到现代生物医药模式的转变，并从新的角度来探索中药的发展。网络药理学以网络靶标作为基础，构建“中药-有效成分-靶点-疾病”的网络构图，预测相关治疗靶点、并建立网络靶点与体外、体内实验的相关性。在网络药理学的帮助下，能够快速地筛查出治疗缺血性脑卒中的中药有效成分及其作用靶点，对中药防治缺血性脑卒中具有重大意义。