黄芩苷通过阻断2型固有淋巴细胞激活减轻脓毒症肺损伤机制研究*

温 霞 陈恩就 孙 俊 姜小珍 王珊瑚

1 平阳县人民医院 浙江 平阳 325400

2 温州医科大学附属第二医院 浙江 温州 325000

脓毒症的特征是宿主细胞促炎和抗炎因子的相互作用，导致炎症网络的严重失调[1]。大量炎症细胞因子通过血液循环会造成相关的急性肺、肾脏和其他器官的损伤，因此抗感染治疗成为脓毒症最有效的治疗方法[2]。先天性淋巴细胞（Innate lymphoid cells，ILCs）是近年来备受关注的一类细胞，因为其可以跨越先天免疫系统和适应性免疫系统之间的桥梁，诱导分泌多种细胞因子，这些细胞因子影响感染/损伤部位产生的免疫反应类型[3]。ILCs 根据其分泌的细胞因子可分为3 个亚组，其中第2组ILCs（ILC2s）不仅是启动先天性免疫反应所必需的，而且还通过IL-13 支持Th2 细胞的生成[4]。ILC2s 通常与黏膜屏障表面有关，在调节对入侵病原体的先天性和适应性免疫反应方面起着重要作用。黄芩苷（Baicalin，BA）是从黄芩干根中提取的一种黄酮类化合物，具有多种生物活性[5]，可以抑制Th1和Th17反应，促进Treg 反应，从而减轻脓毒症胰腺损伤[6]。关于BA对脓毒症中ILC2s的影响尚不清楚，本研究旨在观察BA对脓毒症肺损伤的改善作用，及其在脓毒症炎症治疗中的潜在分子机制是否涉及ILC2s的调节。

1 材料与方法

1.1 动物模型：于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证编号：SCXK（京）2016-0006]购买50 只雄性C57BL/6 小鼠，体重22～26g（8～10 周龄）。采用盲肠结扎穿孔法（Cecal ligation and puncture，CLP）建立脓毒症模型[6]。将50 只小鼠随机分为5 组（n=10）：假手术组、模型组、BA 低剂量组（BA-L，100mg/kg）、BA 中剂量组（BA-M，200mg/kg）和BA 高剂量组（BA-H，300mg/kg）。在无菌条件下中线切一个小口暴露盲肠。随后，在距远端1.5cm 处用丝线结扎盲肠。然后，用一根18 号的针进行两次穿刺，排出少量粪便。之后，盲肠在腹部缝合前被移到腹腔。术后腹腔注射生理盐水（24mL/kg）复苏。假手术组除CLP 外均行手术。BA-L 组、BA-M 组和BA-H 组小鼠灌胃BA（上海纯优生物科技有限公司，纯度≥98%）每日1次，连续3 天。假手术组和模型组每天同时灌胃等量生理盐水。实验中没有小鼠意外死亡。3 天后，麻醉并处死所有小鼠进行外周血和肺组织取样。

1.2 组织病理学和损伤评分：收集肺组织，用4%多聚甲醛固定。组织脱水，包埋在石蜡中，切成5μm厚切片，苏木精和伊红（HE）染色。肺损伤以肺泡充血出血、中性粒细胞浸润血管壁或肺泡壁增厚为特征。每个特征的缺失（0）或存在被分为轻度（1）、中度（2）和重度（3），确定总累积组织学评分[7]。随机选取8 个高倍镜区，平均值为每个标本的病理学评分。

1.3 肺和外周血中ILC2s 的流式细胞术分析：用GentleMacs 小鼠肿瘤组织解离试剂盒（德国Miltenyi Biotec 公司）对肺组织进行混合消化，从肺组织中制备单细胞悬浮液，然后在37℃下用1mg/mL 胶原酶IA 和20μg/mL DNaseI 染色30min。抗凝外周血样本和肺细胞悬浮液通过70μm 尼龙网过滤，红细胞裂解液处理，PBS（含2%胎牛血清）洗涤。首先用抗CD16/32 单克隆抗体（2.4G2，杭州联科生物技术股份有限公司）孵育10min，阻断Fc 受体。然后用APC-effluro 780 结合抗-CD45（美国eBioscience公司）、PerCP-cy5.5-结合抗谱系标记物（CD3e、CD11b、CD45R/B220、Ly-76、Ly-6G 和Ly-6C）（美国BD-Pharmingen公司）、FITC结合抗Thy1.2（美国eBioscience 公司）和APC 结合抗ST2（美国Biolegend 公司）的混合物对细胞进行染色。ILC2s 被鉴定为CD45+Lin-Thy1.2+ST2+。使用流式细胞仪分析样本。

1.4 支气管肺泡灌洗液（BALF）分析：在最后一次给药24h后收集BALF。将气管通过一根22英寸的静脉导管插管，用1mL PBS 对肺进行灌洗，连续3 次获得BALF。将BALF在300rpm、4℃下离心10min。然后收集上清液的样本并在−80℃下储存以进行进一步分析。用流式细胞仪分析细胞总数。BALF 细胞总数和嗜酸性粒细胞数显示为每毫升BALF 的细胞数。使用小鼠ELISA 试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司）测定BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13水平。

1.5 Western Blotting 分析：将小鼠肺组织进行蛋白质提取。用Pierce BCA 蛋白检测试剂盒检测蛋白质浓度。随后，将蛋白质样品（50μg）用5×样品缓冲液煮沸，并在SDS-PAGE 上电泳转移到聚偏氟乙烯膜上。将膜暴露于封闭缓冲液中2h，在4℃下与一级抗体IL-33（1∶1000）、抗ST2（1∶1000）或GAPDH 抗体（1∶1000；均购自美国Cell Signaling Technology 公司）孵育过夜，然后在室温下与HRP 结合的二级山羊抗兔IgG（1∶2000）一起孵育1h。最后用化学发光法在Tanon 5200 Multi 全自动化学发光（上海天能科技有限公司）观察结果。

1.6 细胞培养与治疗：正常人支气管上皮（NHBE）细胞系购自美国ATCC，并在含10%胎牛血清、100μg/mL链霉素和100 单位/mL 青霉素的DMEM 培养基（美国Invitrogen 公司）中培养。将1×106细胞接种于6 孔板中，加入或不加入100 ng/mL LPS 和BA（1.25、2.5、5.0μmol/L）培养6h。

1.7 RNA 分离与定量PCR 分析：用TRIzol 试剂（美国Ambion 公司）从肺组织匀浆中或细胞中提取RNA。用PrimeScript RT-Master Mix 试剂盒（日本TaKaRa 公司）生成cDNA。使用SYBR Green Master Mix试剂盒（美国Applied Biosystems 公司）在Applied Biosystems ABI 7500（美国Thermo Fisher Scientific 公司）进行实时PCR。靶基因的相对表达用相对定量的比较法计算，并将数据归一化到对照组。基因表达水平用2-△Ct法进行，并标准化为GAPDH 的表达。用于qPCR 扩增的基因特异性引物序列设计见表1。

表1 基因特异性引物序列

1.8 数据处理：使用SPSS 21.0 软件进行分析。统计分析采用两组间的t检验或多组间Tukey多重比较检验的单因素方差分析。P＜0.05认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 BA 对脓毒症小鼠肺组织病理学影响：假手术组小鼠肺标本未见明显组织学改变。CLP 可导致模型组小鼠出现严重的损伤，表现为炎性小体弥漫性浸润，中性粒细胞明显向肺泡腔募集，气管固有层变薄、水肿。值得注意的是，BA 可逆转CLP 对肺组织的影响，尤其是高剂量治疗组。这些结果证明BA 对治疗脓毒症肺部炎症损伤是有益的。

图1 肺组织炎症损伤的HE染色（A）及肺损伤评分（B）

2.2 BA 减轻脓毒症小鼠炎症反应：与对照组比较，模型组BALF 细胞总数和嗜酸性粒细胞明显增多（P＜0.001）。用BA 处理可显著降低BALF 中的总细胞数和嗜酸性粒细胞数（P＜0.05）（图2A-B）。此外，CLP 可诱导小鼠肺IL-4、IL-5和IL-13基因水平显著上调（P＜0.05）。BA 处理不同程度下调肺组织中IL-4、IL-5 和IL-13 mRNA 表达（P＜0.05），其中以高剂量BA 作用最强（P＜0.01）（图2C）。同样，模型组BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13的水平较对照组明显升高（P＜0.01），而中、高剂量BA处理后IL-4、IL-5 和IL-13 水平降低（P＜0.05）（图2D）。

2.3 BA 通过IL-33/ST2 轴抑制CLP 诱导的小鼠ILC2s成熟：小鼠肺ILC2s 成熟和激活的表型鉴定为ST2、Thy1.2阳性。与Sham组比较，模型组大鼠肺和外周血内ST2+Thy1.2+ILC2s 含量明显增加（P＜0.001）。低剂量至高剂量BA 显著降低ST2+Thy1.2+ILC2s 数量（P＜0.001）（图3A-B）。IL-33/ST2 轴在肺ILC2s 的激活和引起气道炎症中起关键作用。在模型组中，肺匀浆中IL-33 和ST2 的蛋白和mRNA 表达均上调（P＜0.001）。BA 从低剂量到高剂量均显著下调肺匀浆中IL-33和ST2的蛋白和mRNA 表达（P＜0.05）（图3C-D）。因此，BA 可以减轻CLP 诱导的气道炎症，其作用机制至少部分通过破坏IL-33/ST2轴抑制ILC2s的成熟。

图3 BA通过IL-33/ST2轴抑制CLP诱导的小鼠ILC2s成熟

2.4 BA 抑制LPS 刺激后气道上皮细胞IL-33 的表达：经LPS刺激6小时后，NHBE细胞中IL-33 mRNA表达较对照组显著升高（P＜0.01）（图4A）。BA 处理可显著降低LPS 诱导的IL-33 mRNA 表达升高（P＜0.01）（图4B）。这些结果表明BA 可能通过下调气道上皮细胞中IL-33 的产生而减弱IL-33/ST2轴介导的炎症反应。

图4 BA抑制LPS刺激后气道上皮细胞IL-33的表达

3 讨论

CLP 模型与其他动物模型相比有许多优点，它符合人类感染的自然过程，表现出相似的血流动力学变化，并诱发不同程度的脓毒症严重程度[8]。在本实验中，CLP 诱导的小鼠肺组织出现严重的损伤。BA 能调节Th1、Th17 和Treg 反应，减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎、过敏性哮喘和结肠炎[9]。BA在小儿脓毒症中通过抑制BAX 和促进BCL2 发挥抗急性肾损伤的作用[10]。BA 可抑制巨噬细胞释放高迁移率族盒1，可能是脓毒症相关疾病的潜在治疗策略[11]。本研究中，BA 能显著减轻脓毒症相关性肺损伤和炎症程度，证实了先前报道的BA对脓毒症相关反应有改善作用。

由于肺内ILC2s 被认为是2 型细胞因子传播2 型炎症的早期来源，因此ILC2s可能在介导脓毒症的炎症反应中起关键作用[4]。本研究中，脓毒症小鼠肺内成熟表型的ILC2s数量显著增加，并且BALF中IL-5和IL-13的产生可能部分反映了ILC2s 依赖性免疫反应的促进作用。此外，BA 可抑制肺内ILC2s 成熟。这些证实ILC2s可能作为脓毒症急性肺损伤期间BA治疗的早期靶向炎症细胞。

ILC2s 组成性地表达ST2，并在过敏原激发或感染后迅速对IL-33 作出反应，增殖和细胞因子生成增加[12]。IL-33/ST2 信号对于肺IL-5 和IL-13 的产生和气道嗜酸性粒细胞增多（独立于适应性免疫）是必需的[13]。IL-33 依赖性IL-5 和IL-13 的产生能促进皮肤伤口愈合，是皮肤上皮细胞和免疫系统之间的重要纽带[14]。IL-33 通过促进ILC2s 增殖及其产生IL-4、IL-5和IL-13 来预防实验性脑疟疾[15]。在小鼠模型中，IL-33 通过ST2 信号激活驻留肺部的ILC2s[13]。与此一致，在本研究中，脓毒症小鼠肺中IL-33 和ST2 的表达均上调，而BA 处理后则下调。这些结果提示BA 可能通过IL-33/ST2 轴影响肺内ILC2s 的激活。有研究发现[16]，IL-33 在暴露于LPS 的气道上皮细胞中显著上调，而BA则下调。表明BA除抑制ILC2s增殖外，还可能对上皮细胞IL-33产生作用。

综上所述，BA 可以通过靶向IL33/ST2 轴抑制脓毒症小鼠气道中ILC2s介导的炎症反应。此外，BA抑制气道上皮细胞IL-33-ST2 轴，这是一个强有力的促炎途径，在LPS 暴露时触发过炎症级联反应。因此，BA 可作为未来辅助治疗脓毒症的潜在药物。