tRF-011690对阿霉素诱导的足细胞自噬的影响

赵唐明，王 娥，张琳琳，黄 婵，甘卫华

南京医科大学第二附属医院儿肾科，江苏 南京 210003

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是指肾脏结构或功能异常超过3 个月的一类疾病，主要病理表现为肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化。CKD是一个全球性的重大公共卫生问题，发展为终末期肾病后只能依靠血液透析、腹膜透析及肾脏移植等维持生命，造成了严重的家庭和社会经济负担［1-3］。

自噬是真核细胞将胞内物质降解并循环利用的过程，其在细胞、组织和生物体稳态中起重要作用，自噬相关基因突变与人类疾病之间存在明确的病因学联系［4］。研究表明，肾脏中基础水平的自噬对维持内环境稳态至关重要，但在炎症、饥饿及缺氧等应激条件下，自噬失调可导致足细胞的损伤和缺失，从而进一步造成肾脏损害，急性肾损伤、肾脏纤维化以及CKD中都涉及这一机制［5］。因此，对足细胞自噬的深入研究具有重要临床意义。

tRNA 的衍生片段（transfer RNA-derived RNA fragment，tRF）属于非编码小RNA家族，在细胞或组织中由RNA 核酸内切酶切割tRNA 产生，根据切割位点的不同，可产生不同类型及功能的tRF［6］。已有许多研究表明tRF在癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等多类疾病中发挥作用，具有巨大的临床价值和应用潜力［7-8］。在肾脏疾病中，Shi 等［9］研究发现tRF 参与足细胞分化与损伤、肾小管细胞纤维化等病理过程。

本课题组通过高通量测序在分化的足细胞中发现多条差异表达的tRF，其中表达下调的AS-tDR-011690、tDR-003634和AS-tDR-13354被证实参与足细胞损伤，其中tRF-011690低表达最为显著，且目前尚未有研究探讨tRF-011690与足细胞损伤的关系及机制，因此本研究选择tRF-011690为研究对象。此外，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析显示mTOR信号通路与差异表达的tRF之间存在紧密联系［10］。有研究证实，mTOR 信号通路与肾自噬相关［11］，因此，本研究通过探讨tRF-011690 在阿霉素（adriamycin，ADR）诱导的足细胞损伤中的作用，以及tRF-011690 与mTOR 信号通路间的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

永生化小鼠足细胞（MPC5）由南京医科大学第二附属医院肾脏病研究中心馈赠。ADR 和mTOR特异性磷酸化抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）（Med Chem Express公司，美国）；干扰素（interferon，IFN）-γ（Pepro Tech公司，美国）；tRF-011690 mimic试剂盒、RT-qPCR 试剂盒及U6、tRF-011690 引物（广州锐博生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂、Opti-MEM 试剂及Trizol 试剂（Invitrogen 公司，美国）；β-actin和p62抗体（Affinity Biosciences公司，美国）；LC3Ⅱ/Ⅰ和p-mTOR 抗体（Cell Signaling 公司，美国）；羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（南京凯基生物技术有限公司）。β-actin、p62、LC3和mTOR的PCR引物由上海锐真生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MPC5细胞在含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL）及1%IFN-γ（10 U/mL）的RPMI-1640 培养基中培养，置于33 ℃、5%CO2的细胞培养箱内；每隔1～2 d换液，镜下视野细胞融合至80%～90%时进行传代，置于不含双抗和IFN-γ的完全培养液，放入37 ℃、5%CO2的细胞培养箱内分化10～14 d；每隔1～2 d更换培养液1次，待细胞融合率为60%～70%时更换无血清培养基继续培养12 h使细胞同步化，收集细胞以备后续实验。

1.2.2 tRF-011690过表达转染

将对数生长期足细胞接种至6 孔板，按脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 操作说明书操作，用50 nmol/L 的tRF-011690 mimic 和tRF-011690 NC 以及Lipofectamine 2000 转染试剂转染细胞。培养4～6 h后，更换完全培养基用ADR干预24 h。

1.2.3 细胞干预实验

观察过表达tRF-011690对足细胞自噬的影响，细胞用ADR（1 μg/mL）［10］干预，分为Control组、ADR组、ADR+tRF-011690 mimic 组和ADR+tRF-011690 NC组。观察阻断mTOR信号通路对tRF-011690及足细胞自噬的影响，用ADR（1 μg/mL）与Rapamycin（200 ng/mL）［12］干预，分为Control 组、ADR 组、ADR+Rapamycin组与Rapamycin组。

1.2.4 RT-qPCR检测目的基因的表达水平

用Trizol 试剂盒提取各组总RNA，利用分光光度计对每个样品的RNA 浓度和纯度进行检测。根据反转录试剂盒说明书制备cDNA；根据RT-qPCR试剂盒说明书进行PCR 扩增反应。依据熔解曲线进行产物的特异性分析。U6 作为内参，采用2-ΔΔCT法计算tRF-011690相对表达量。β-actin作为内参，采用2-ΔΔCT法计算p62、LC3和p-mTOR mRNA的相对表达量。各样本均设置3 个复孔，实验重复3 次。目的基因引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5 Western blot法检测目的蛋白表达水平

收集干预完成的足细胞，弃去培养基，PBS冲洗后置于4 ℃冰上，加入RIPA 及蛋白酶抑制剂PMSF进行裂解，细胞刮刮下细胞移至1.5 mL EP 管中，冰上裂解40 min，4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，取上清，BCA法测蛋白浓度。每组蛋白上样量为25 μg，经SDS-PAGE 电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入β-actin、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ和p-mTOR 一抗（稀释比例为1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入相应二抗（稀释比例为1∶3 000），室温下置于摇床孵育1 h，洗膜3 次，ECL 显色液显影，凝胶成像仪曝光。Image J软件分析灰度值，以β-actin为内参计算目的蛋白表达量。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8 软件进行统计学分析，数据用均数±标准差（）表示，用t检验进行两组间比较，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行多组间比较分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达tRF-011690对足细胞自噬的影响

RT-qPCR 结果表明，与Control 组相比，ADR 组的tRF-011690 表达水平显著降低（P＜0.05）。与ADR 组及ADR+tRF-011690 NC 组相比，ADR+tRF-011690 mimic 组tRF-011690 表达显著升高，证明tRF-011690过表达成功（P＜0.05，图1A）。

图1 过表达tRF-011690对足细胞自噬的影响

RT-qPCR 结果显示，与Control 组比较，ADR 组LC3 和p62 mRNA 表达量明显上升（P＜0.05），与ADR+tRF-011690 NC 组相比，ADR+tRF-011690 mimic 组LC3 和p62 mRNA 表达量减少（P＜0.05，图1B）。Western blot结果表明，与Control组比较，ADR组的LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白表达量明显上升（P＜0.05），与ADR+tRF-011690 NC 组相比，ADR+tRF-011690 mimic组LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白表达量减少（P＜0.05，图1C、D）。

2.2 阻断mTOR信号通路对tRF-011690及足细胞自噬的影响

RT-qPCR 结果表明，与Control 组相比，ADR 组mTOR 表达水平上升、tRF-011690 表达水平下降（P＜0.05），与ADR 组相比，ADR+Rapamycin 组mTOR 表达水平下降、tRF-011690 表达水平升高（P＜0.05，图2A、B）。Western blot 结果表明，与Control组相比，ADR组p-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白表达量增加（P＜0.05），与ADR组相比，ADR+Rapamycin组p-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白表达量降低（P＜0.05，图2C～F）。

3 讨论

CKD 是由多种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍，其病理过程十分复杂，涉及多种细胞因子和信号通路。目前CKD治疗手段有限，只能一定程度上延缓疾病进程，因此寻找特异且有效的治疗靶点迫在眉睫。

足细胞作为肾脏最重要的固有细胞之一，是肾小球滤过屏障的重要组成部分，可以阻止蛋白从尿液丢失，对维持肾脏结构和功能的稳定具有重要意义［13-14］。研究表明足细胞功能失调与自噬关系密切，足细胞自噬在一定程度上会造成足细胞数量减少，而足细胞数量减少是预测肾脏疾病进展的重要指标［15］，自噬失调会导致肾脏疾病进展产生大量蛋白尿。

tRF 作为新型非编码RNA，是来自成熟tRNA或前体tRNA 的衍生片段，研究表明tRF 并不是tRNA 的随机降解产物，它在不同状态的干细胞中差异表达，分别在转录、转录后和表观遗传水平调控基因表达，在细胞周期、氧化应激、凋亡、自噬等生物学过程中发挥重要调节作用［16-18］。本课题组前期通过高通量测序发现，正常足细胞与ADR造成的损伤足细胞之间存在许多差异表达的tRF，选取低表达改变最为显著的tRF-011690 进行后续功能和机制研究。课题组前期研究ADR 诱导肾病小鼠模型，证明ADR能够诱导足细胞凋亡［19］。自噬流是一个由多个步骤组成的动态过程，自噬流阻滞时LC3Ⅱ/Ⅰ和p62 可能同时升高［20-21］。本研究发现ADR组LC3Ⅱ/Ⅰ和p62 蛋白表达量均明显上升，这可能与实验过程中检测自噬标志蛋白的时间密切相关，后续研究可以设置多个时间节点对LC3Ⅱ/Ⅰ和p62进行检测，进一步完善研究结果。本研究Western blot检测ADR组LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白表达量均明显上升，并且在ADR 诱导的足细胞损伤模型中，细胞自噬水平升高，tRF-011690 表达量下降。进一步在足细胞中过表达tRF-011690，结果显示与ADR 组及ADR+tRF-011690 NC 组相比，ADR+tRF-011690 mimic组LC3和p62 mRNA表达明显降低，LC3Ⅱ/Ⅰ和p62 蛋白表达也明显降低，表明过表达tRF-011690能够调节ADR诱导的足细胞自噬。

mTOR信号通路是调节细胞自噬的重要通路，在营养缺乏、缺氧和药物治疗诱导的应激条件下，mTOR通路对自噬的调控是细胞存活的关键机制［21］。mTOR 可以分为mTOR 复合物1（mTORC1）和复合物2（mTORC2），其中mTORC1 是细胞自噬的重要调节器，Rapamycin 及其类似物可以通过抑制mTORC1 活性来阻断mTOR 信号通路，进而抑制自噬［22］。课题组前期通过KEGG 分析筛选出多条与tRF相关的信号通路，在这些信号通路中，本研究显示ADR干预足细胞后mTOR信号通路中的关键蛋白p-mTOR表达量显著升高，因此猜想tRF-011690是否通过该信号通路影响足细胞自噬。用Rapamycin阻断mTOR 信号通路后通过测量tRF-011690 的表达水平来探究这二者之间的联系。结果表明，阻断mTOR信号通路后，tRF-011690表达上调，足细胞自噬被抑制，推测tRF-011690可能作为mTOR通路的下游效应分子发挥抑制足细胞自噬的作用。

综上所述，本研究发现ADR 干预足细胞后，自噬水平升高，mTOR 信号通路被激活，tRF-011690表达下调。过表达tRF-011690 后，可以降低ADR诱导的足细胞自噬水平；进一步阻断mTOR 信号通路后，足细胞自噬水平降低，tRF-11690 表达上调。本研究的主要目的在于探索tRF-011690 对ADR 诱导肾病小鼠足细胞自噬的影响，同时研究tRF-011690 与mTOR 信号通路间可能的作用方式，以便为CKD的治疗研究提供一个新的研究思路。