山竹皮单宁提取与纯化工艺

蒋红芝，韦林双

（广西农业职业技术大学食品药品工程学院，南宁 530007）

山竹（Garcinia mangostanaL.）是藤黄科藤黄属植物。一般在热带地区生长，分布于泰国、马来西亚以及中国广东省、海南省等地。新鲜的山竹颜色为暗红色，鲜艳有光泽。放置时间过长后颜色会变成棕色，果皮会变硬，果肉会变黑色或黄色，口感变差。山竹皮性寒、味苦、涩，具有清热解毒的功效，皮内含有单宁酸，能与微生物的蛋白质发生沉淀，使蛋白质达到凝固的效果，帮助身体杀死细菌。山竹皮中的单宁具有抗氧化活性、抗菌活性、抗炎作用、增强免疫及抗肿瘤作用等功效，广泛应用于化妆品、食品饮料、医药保健等领域。山竹皮中的多酚提取工艺研究虽有报道［1］，但对山竹皮中单宁的提取［2］和纯化研究较少。本研究对山竹皮中单宁的提取与纯化工艺进行分析，采用乙醇为提取溶剂，大孔树脂分离纯化，旨在为山竹皮单宁提取与分离纯化提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料、试剂及仪器

材料：山竹购买于超市，大孔树脂为AB-8、D101（安徽三星树脂科技有限公司），ADS-21、HPD826、NKA-9（上海一基实业有限公司）。

试剂：单宁酸（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）、无水乙醇，分析纯。

仪器：AS 220.R2 型电子天平（苏州培科实验室仪器科技有限公司）；2500Y 型高速多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；SB-5200D 型超声波清洗机（功率200 W，宁波新艺超声设备有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；TU-1901 型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RE-2000B型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；HP-B500 型电子天平（福建莆田市华杰电子仪器有限公司）；层析柱、HL-2B 型恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；DBS-100 型电脑全自动部分收集器（上海沪西分析仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 山竹皮单宁的提取工艺流程 山竹皮→清洗→烘干（50 ℃干燥24 h）→粉碎→过筛（60 目）［3，4］→称取一定量山竹皮粉加入一定体积的乙醇溶液→在超声波清洗机中按一定的温度和时间进行振荡→冷却→真空泵抽滤→收集滤液→定容→取一定量滤液加纯化水定容至刻度线→测定吸光度，平行提取2份。

1.2.2 单宁酸的标准曲线及曲线方程 单宁酸标准液的配制：准确称取单宁酸0.050 5 g，用纯化水溶解并定容至100 mL，浓度为505 μg/mL［2］。

单宁光谱扫描吸收曲线绘制：吸取上述溶液2.5 mL，加纯化水至100 mL，于波长200～400 nm 处扫描，测定吸光度，确定最大吸收波长，用于绘制标准曲线。

单宁标准曲线绘制：精密量取0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 的单宁标准液于50 mL 容量瓶中，加纯化水至刻度，摇匀，在最大吸收波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

1.2.3 紫外分光光度法对山竹皮单宁的含量测定根据下面的算式计算单宁的提取率。

式中，c为提取液稀释液浓度（μg/mL）；n为稀释倍数；m为山竹皮粉末质量（g）；V为提取液的体积（mL）。

1.2.4 单因素试验

1）乙醇体积分数对山竹皮单宁提取效果的影响。分别精密称定8 份0.25 g 山竹皮粉，分别放入100 mL 具塞锥形瓶中，按料液比1∶200（g∶mL，下同）分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%的乙醇溶液50 mL，50 ℃超声辅助提取40 min。

2）提取时间对山竹皮单宁提取效果的影响。分别精密称定8 份0.25 g 山竹皮粉，按料液比1∶200，各加入50%乙醇溶液50 mL，温度控制在50 ℃，超声波辅助分别提取25、35、45、55 min。

3）提取温度对山竹皮单宁提取效果的影响。分别精密称定8 份0.25 g 山竹皮粉，按料液比1∶200，各加入50%乙醇溶液50 mL，分别设置水浴温度为40、50、60、70 ℃，超声波辅助提取45 min。

4）料液比对山竹皮单宁提取效果的影响。分别精密称定1.00、0.50、0.33、0.25、0.20 g 山竹皮粉，分别放入100 mL 具塞锥形瓶中，各加入50%乙醇溶液50 mL，即料液比为1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250，60 ℃超声辅助提取45 min。

1.2.5 正交试验 根据单因素试验结果，以单宁的提取率为考察指标，确定提取乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比为影响因素，每个因素取3 个水平，取各因素的最优试验范围［5，6］。在单因素试验的基础上，采用四因素三水平设计L9（34）试验进行正交试验优化，确定山竹皮单宁提取的最佳工艺。

1.2.6 山竹皮单宁的纯化

1）大孔树脂预处理。称取适量5 种大孔吸附树脂AB-8、D101、NAK-9、ADS-21、HPD826，分别装到烧杯内，加入95%乙醇浸泡24 h 后，用纯化水冲洗至无醇味，处理好的树脂加纯化水浸泡，备用。

2）大孔树脂的筛选。静态吸附：取减压浓缩（50～60 ℃）后的山竹皮单宁浓缩液，稀释一定倍数，测定其吸光度为0.471，计算出其质量浓度为0.33 mg/mL。量取30 mL 山竹皮单宁浓缩液，分别加入盛有10.00 g 已处理好的5 种大孔吸附树脂AB-8、D101、NAK-9、ADS-21、HPD826 的烧杯中进行静态吸附，分别在30、60 min 移取各吸附液1 mL 至50 mL 容量瓶中，用纯化水定容、摇匀，测定吸光度。计算吸附量及吸附率［7］。

静态洗脱：使用纯化水洗涤大孔树脂2 次，滤干。以乙醇作为洗脱剂，每种树脂各称取2.00 g，各3 份，分别加入体积分数为55%、75%、95%的乙醇溶液10 mL，洗脱30 min 取样分析，洗脱60 min，过滤洗脱液，用纯化水定容至50 mL，测定吸光度，计算洗脱率。计算式如下。

式中，m为单宁量（μg），c为浓度（μg/mL）；V为体积（mL）；n为稀释倍数。

式中，m0为单宁初始总量（μg）；m1为吸附后的剩余量（μg）；m2为洗脱的单宁量（μg）；c0为原始浓度（μg/mL）；c1为吸附后剩余的单宁浓度（μg/mL）；c2为洗脱的乙醇含单宁的浓度（μg/mL）；V为提取液的体积（V0为原始的提取液体积、V1为加入吸附的提取液体积、V2为加入洗脱的乙醇体积）（mL）；n为稀释倍数。

3）动态吸附和洗脱。单宁样品的动态吸附：取适量处理好的ADS-21、HPD826大孔树脂（各25.00 g）放入250 mL 的烧杯中，分别加入75 mL 的山竹皮浓缩液进行超声振荡（常温，30、60 min）测定吸光度。通过吸附可以观察到白色的大孔树脂颗粒因吸附山竹单宁而变色，并带有山竹皮本身的粉色。

单宁样品的洗脱：将吸附好的大孔树脂经处理后上柱，静置一段时间，让吸附有单宁的大孔树脂充分填充。使用75%乙醇作为洗脱液，将树脂中的单宁洗脱。用全自动部分收集器收集16 管洗脱液（3 min/管，恒流泵流速60 mL/min），可以观察到流出的洗脱液第2 至第6 管均带有颜色［8］，后面流出的变浅至无色。

4）纯化的单宁产品。对洗脱液进行减压浓缩得到纯化的山竹皮单宁液，再经真空干燥即得纯化后的单宁产品。

2 结果与分析

2.1 单宁吸收曲线和标准曲线方程

单宁酸的光谱扫描吸收曲线如图1 所示。单宁在波长275 nm 处具有最大吸收峰。山竹皮提取液光谱扫描吸收曲线如图2 所示，在波长276 nm 处具有最大吸收峰。与单宁酸对比，说明山竹皮提取液中含有单宁酸。于固定波长275 nm 处测定山竹皮提取液稀释后的吸光度，计算山竹皮提取液中单宁的含量。在TU-1901 型双光束紫外分光光度计定量分析界面，设置参数，输入浓度，以纯化水为参比溶液，依次测出不同浓度的吸光度［2］，仪器自动绘出标准曲线，得到线性回归方程为c=25.889 89A+0.128 82，R＝0.999 139。

图1 单宁酸的光谱扫描吸收曲线

图2 山竹皮提取液光谱扫描吸收曲线

2.2 单因素试验对山竹皮单宁提取率的影响

2.2.1 乙醇体积分数对山竹皮单宁提取率的影响在波长275 nm 处测定溶液的吸光度，以提取率代表山竹皮中单宁的含量。经过平行试验统计［9］，乙醇体积分数对山竹皮单宁提取率的影响结果见图3。乙醇体积分数为40%、50%时曲线呈上升趋势，单宁含量增加。乙醇体积分数为60%、70%时曲线呈下降趋势，单宁含量减少。当乙醇体积分数为50%时，山竹皮中单宁的含量最高。故最优乙醇体积分数为50%。

图3 乙醇体积分数对山竹皮单宁提取率的影响

2.2.2 提取时间对山竹皮单宁提取率的影响 提取时间对山竹皮单宁提取率的影响结果见图4。提取时间45 min 时，山竹皮中单宁的提取率最高，45 min后基本不变。有研究表明，时间过长，会使得单宁中的酚羟基经氧化反应变成酮基，从而使得提取量下降［10］。加热时间为45 min 时提取山竹皮中单宁的含量最高，故提取时间选择45 min。

图4 提取时间对山竹皮单宁提取率的影响

2.2.3 提取温度对山竹皮单宁提取率的影响 提取温度对山竹皮单宁提取率的影响结果见图5。提取温度在40、50、60 ℃时，随着温度的提高，山竹皮中单宁的提取率呈上升趋势，60 ℃后呈下降趋势。故提取温度为60 ℃时效果较好。

图5 提取温度对山竹皮单宁提取率的影响

2.2.4 料液比对山竹皮单宁提取率的影响 料液比对山竹皮单宁提取率的影响结果见图6。料液比为1∶50、1∶100 时曲线下降，单宁提取率下降。料液比为1∶100 后曲线上升，单宁提取率增加，但料液比越大成本越高，故选择了料液比为1∶200。

图6 料液比对山竹皮单宁提取率的影响

2.3 山竹皮单宁提取的正交试验

根据单因素试验结果，以单宁的提取率为考察指标，设计四因素三水平L9（34）试验［11-13］。正交设计及结果见表1，通过比较极差可知，乙醇体积分数对山竹皮中单宁的提取率影响最大，其次为提取温度及料液比，提取时间对山竹皮中单宁的提取率影响最小。从正交试验中可得A2B3C3D3均值最高，并对其进行验证试验，其提取率为10.78%。故提取山竹皮中单宁含量的最佳工艺条件为乙醇体积分数50%，料液比1∶225，提取温度65 ℃，提取时间50 min。

表1 正交结果及分析

2.4 大孔吸附树脂纯化结果

2.4.1 静态吸附、动态吸附结果 选取5 种不同的大孔树脂分别对山竹皮中的单宁进行静态吸附和动态吸附，结果见表2。由表2 可知，静态吸附比动态吸附效果要好，吸附60 min 后基本达到平衡。综合静态、动态吸附的效果，NAK-9、ADS-21、HPD826 大孔树脂吸附较好。

2.4.2 静态洗脱结果 静态洗脱结果见表3。用75%乙醇洗脱时，洗脱率最高，20 min 时间较短洗脱率不高，40 min 时洗脱率较高，60 min 后洗脱率下降。75%乙醇洗脱率比55%、95%的乙醇洗脱率要高。即75%乙醇洗脱率的数值较大，洗脱出来的单宁较多，所以选择75%乙醇作为柱层析洗脱液进行洗脱。

表3 乙醇洗脱率结果

55%、95%乙醇洗脱时，NAK-9 大孔树脂洗脱效果较差，HPD826、AB-8、D101 洗脱效果较好，但洗脱率均不高。75%乙醇洗脱时，40 min 时AB-8 树脂洗脱率最高，60 min 后洗脱率最低，分析原因有可能是出现重新吸附造成的，ADS-21、NAK-9、HPD826洗脱效果较好，D101 稳定性较差。总体来看，ADS-21、HPD826 大孔树脂洗脱效果较好。

由以上分析可知，ADS-21、HPD826、NAK-9 大孔树脂吸附较好，但ADS-21、HPD826 大孔树脂洗脱效果较好，综合考虑吸附率和洗脱率2 个因素，得出ADS-21、HPD826为该试验适宜的纯化大孔树脂。

2.4.3 动态洗脱（柱层析）结果 动态洗脱（柱层析）结果如图7 所示，山竹皮单宁经ADS-21、HPD826 大孔树脂吸附柱层析分离后，均出现1 个洗脱峰。与HPD826 大孔树脂相比，ADS-21 大孔树脂吸附柱层析的洗脱峰较窄，洗脱出来的单宁比较集中，即分离洗脱的效果较好［4］，所以选择ADS-21 大孔树脂对山竹皮单宁进行洗脱。

图7 ADS-21、HPD826 柱层析结果对比

3 小结

1）以山竹皮为原料通过单因素试验与正交试验确定山竹皮中单宁最优提取工艺为50%乙醇，料液比1∶225，提取温度65 ℃，提取时间为50 min，提取率可达10.78%。

2）从5 种大孔树脂中筛选出吸附和洗脱效果较好的ADS-21、HPD826 大孔树脂，根据ADS-21、HPD826 大孔树脂静态、动态吸附，静态、动态洗脱试验结果，得出ADS-21 大孔树脂为分离纯化山竹皮中单宁的最佳树脂。