花椒根腐病拮抗菌W-5 的鉴定及发酵条件的优化

田凤鸣，陈强，何九军，王国斌，张晓娜

(1. 陇南师范高等专科学校农林技术学院/陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃 陇南 742500；2. 陇南市武都区花椒服务中心，甘肃 陇南 742500)

花椒根腐病是一种危害性极强的土传病害，严重时能造成椒树死亡。 前期研究鉴定认为，引起甘肃陇南武都花椒种植区根腐病的病原菌为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)[1]。 随着化学农药减量化防治的推广，花椒根腐病的生物防治成为当前研究的热点，也是获得一种可持续且安全有效的病害防治方案的重要选项。 拮抗菌对病原菌具有高度特异性，绿色环保是拮抗菌在防治植物病害中所具有的优点[2]。 农药商业化生产中，越来越多的优良微生物菌种资源被开发成生防制剂，且其防治效果受到好评。 植物病害生物防治中芽孢杆菌显示出巨大的潜力和应用前景[3]。

响应面分析法现已成为优化拮抗菌发酵培养的常用手段，该方法的特点是能节约时间和减少试验次数，克服了单因素试验存在的不足[4-8]。目前有关花椒根腐病拮抗菌的资源较少，优良菌种资源更是相对匮乏，已报道的对花椒根腐病具有良好拮抗作用的菌株有淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)[9]、蜡样芽孢杆菌[10]、绿色木霉和哈茨木霉[11]、贝莱斯芽孢杆菌T-1[12]。 本研究于2021 年以引起花椒根腐病的主要致病真菌腐皮镰刀菌为指示菌，采用土壤平板稀释法和平板对峙法分离获得花椒根腐病拮抗菌W-5，继而对其进行形态学观察和分子生物学鉴定，测定其抑菌活性，并基于单因素试验结合Box-Behnken 设计的响应面法对菌株W-5 的最佳发酵条件进行优化，以期为花椒根腐病拮抗生物菌剂的开发与应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 指示菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)H1 和拮抗菌W-5 分别从患有花椒根腐病的花椒根部组织和根系土壤中分离获得，保存于陇南师范高等专科学校农林技术学院微生物实验室。 用于广谱抑菌试验的病原菌(藤仓赤霉菌、禾谷镰刀菌、梅毒镰刀菌、层生镰刀菌)由江西师范大学杨慧林老师惠赠，核桃炭疽病松针刺盘孢菌由甘肃农业大学硕士研究生魏彬惠赠。 病原菌保存于4 ℃冰箱备用。

1.1.2 培养基 供试培养基如下。

PDA 培养基(g/L):马铃薯去皮切块称取200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水定容至1 L。

LB 培养基(g/L):酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，溶质溶解后，pH 值用5.0 mol/L NaOH 调至7.0，去离子水定容至1 L。

NYBD 培养基(g/L):酵母浸粉5.0 g，牛肉浸粉8.0 g，葡萄糖10.0 g，调pH 值至7.5，加蒸馏水至1 L。

以上三种培养基均在103.4 kPa 下灭菌21 min。

1.1.3 主要试剂和仪器 胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、葡萄糖、琼脂、氢氧化钠购自国药集团化学试剂有限公司；722N 可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；气浴式摇床，常州高德仪器制造有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；细菌基因组提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.2 拮抗菌的分离、筛选及鉴定

1.2.1 拮抗菌W-5 的分离 称取花椒根系土壤1.0 g，放入100 mL 无菌三角瓶中，加入无菌水90 mL，摇床上180 r/min 培养30 min，静置30 min后，取上清液并将浓度梯度稀释至10-1～10-8。 取10-6、10-7、10-8三个浓度梯度溶液200 μL 涂布于LB 固体培养基中32 ℃培养2 d，之后挑取单菌落，编号为W-5，并将其接种于LB 液体培养基中扩大培养，4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 拮抗菌W-5 的筛选 采用平板对峙法[13]对分离出的拮抗菌W-5 进行抑菌效果测定。 以腐皮镰刀菌为指示菌，用打孔器将其打成直径为6 mm 的菌饼，接种于PDA 培养基中心，距离中心点2 cm 处成品字形放入无菌滤纸片，取W-5 单菌落菌液10 μL 加在滤纸片上，30 ℃恒温培养7 d，测定病原真菌菌落直径，计算抑制率。

1.2.3 拮抗菌W-5 的分子生物学鉴定 利用形态学结合分子生物学的方法对拮抗菌W-5 进行鉴定。 将W-5 菌株接种至LB 培养基上，32 ℃培养2 d，置于光学显微镜下观察其形态，单菌落置于体视显微镜(放大倍数为150×)下观察其形态，同时对其进行革兰氏染色[14]；分子鉴定采用细菌通用引物27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇/1492R:5＇-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3＇进行PCR 扩增，PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。 北京六合华大基因科技有限公司完成基因测序，采用BLAST 完成测序结果的同源性分析，系统发育树构建运用MEGA 7.0 中N-J 法完成[15]。

1.3 拮抗菌W-5 对腐皮镰刀菌前端菌丝生长影响的观察

将1.2.2 中平板对峙法获得的抑菌平板置于体视显微镜(150×)下，观察拮抗菌W-5 对病原菌腐皮镰刀菌前端菌丝生长的影响。

1.4 拮抗菌W-5 对病原真菌抑菌谱的检测

以5 种病原真菌(禾谷镰刀菌、梅毒镰刀菌、藤仓赤霉菌、松针刺盘孢菌和层生镰刀菌)为供试指示菌，采用平板对峙法检测拮抗菌W-5 对各病原真菌的抑制率，其方法同1.2.2。

1.5 拮抗菌W-5 对花椒根片的离体抑菌试验

花椒根片的离体抑菌试验操作步骤参照文献[12]进行。

1.6 拮抗菌W-5 产胞外酶的检测及嗜铁素培养基检测

纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶检测培养基的配制参照文献[16]的方法进行，采用CAS 检测平板进行拮抗菌W-5 产嗜铁素的检测，其制备参照文献[17]的方法进行。

1.7 拮抗菌W-5 发酵条件优化

1.7.1 测定绘制拮抗菌W-5 生长曲线 将拮抗菌W-5 种子液按照1%的比例接入LB 液体培养基中，于30 ℃、180 r/min 摇床上振荡培养，采用可见分光光度法每间隔2 h 测定其OD600值，共测定16 个点，每个检测点设置3 个重复，绘制其生长曲线。

1.7.2 单因素试验筛选最佳发酵条件 前期试验已确定拮抗菌W-5 生长的最佳培养基为NYBD，以此为基础比较不同温度(26、28、30、32、34 ℃)、pH 值(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5)、接种量(1%、3%、5%、7%、9%、11%)、 转速(140、160、180、200、220 r/min )4 个因素对拮抗菌W-5 生长的影响，以其OD600峰值为指标确定最佳单因素发酵条件。

1.7.3 响应面法确定最佳因素组合 在1.7.2 试验基础上，选取温度、pH 值、转速和接种量为自变量，以拮抗菌株W-5 发酵液OD600为响应值进行响应面组合试验，以1、0、-1 表示4 个因素的高低水平进行四因素三水平的响应面分析。 试验因素和水平见表1。 利用Design Expert 11 软件进行响应面设计(表2)，优化拮抗菌W-5 的最佳发酵条件。

表1 优化拮抗菌W-5 发酵培养条件因素与水平的响应面设计

表2 响应面法设计方案和结果

1.8 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2007 对数据进行处理与分析及作图，响应面结果采用Design Expert 11 软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌W-5 的形态特征及革兰氏染色结果分析

拮抗菌W-5 在LB 固体培养基中32 ℃培养2 d，于光学显微镜和体视显微镜下观察菌落形态，结果(图1)显示，菌落较大为乳白色且不透明，边缘不规则，表面粗糙且有褶皱，革兰氏染色为阳性菌。

图1 拮抗菌W-5 的形态特征及革兰氏染色结果

2.2 平板透明圈法检测拮抗菌W-5 产酶能力和嗜铁素检测

三种胞外酶检测结果显示，拮抗菌W-5 在蛋白酶、纤维素酶检测培养基中均可产生较大的降解圈(图2A、B)，而在几丁质酶检测培养基中无降解圈产生。 CAS 检测结果显示有明显的橙黄色嗜铁素的螯合圈(图2C)。

图2 拮抗菌W-5 产酶培养基和嗜铁素培养基的检测

2.3 拮抗菌W-5 对腐皮镰刀菌的拮抗效果及对病原菌前端菌丝生长的影响

培养5 d 后的腐皮镰刀菌菌落直径为110.0 mm (图3A)，接种拮抗菌W-5 的病原菌菌落直径为24.0 mm (图3B)，抑制率高达82.7%。 体视显微镜下观察拮抗菌W-5 对腐皮镰刀菌前端菌丝生长的影响，结果显示，未接种拮抗菌的病原菌菌丝前端呈放射状且菌丝浓密蓬松、粗细均匀(图3C)，接种拮抗菌W-5 的病原菌菌丝前端稀薄、扭曲成畸形，失去了延伸性(图3D)。 以上结果说明拮抗菌W-5 对花椒根腐病病原菌腐皮镰刀菌确有抑制作用且效果良好。

图3 菌株W-5 对腐皮镰刀菌的拮抗效果及对病原菌前端菌丝生长的影响

2.4 拮抗菌W-5 对病原真菌抑菌谱的检测结果分析

为进一步检测拮抗菌W-5 对其他植物病原菌的抑菌活性，采用平板对峙法检测其对5 种病原真菌的抑菌效果，结果显示，拮抗菌W-5 对藤仓赤霉菌的抑制率为74.3%(图4A)，对禾谷镰刀菌的抑制率为74.6%(图4B)，对梅毒镰刀菌的抑制率为62.5%(图4C)，对松针刺盘孢菌的抑制率为70.3%(图4D)，对层生镰刀菌的抑制率为71.4%(图4E)。 表明拮抗菌株W-5 有较为广泛的抑菌活性，具有一定的开发潜力。

图4 拮抗菌W-5 对病原真菌的广谱抑菌效果

2.5 拮抗菌W-5 离体拮抗结果分析

为再次验证拮抗菌W-5 对花椒根腐病病原菌的抑制效果，进行了花椒根片的离体拮抗试验，结果表明:花椒根片在接种无菌水培养7 d 后依然保持原有色泽，无异味产生，根皮与木质部不发生分离，根片周围也无液体产生(图5A)；培养3 d 后接种腐皮镰刀菌的花椒根片则开始变软发黑，逐渐产生病症，且病原菌菌丝缠绕在花椒根片周围，产生的液体使滤纸变色，根皮和木质部发生分离，同时有臭味产生，且病症与大田中典型花椒根腐病的病症相同(图5B)；而接种拮抗菌W-5和病原菌的花椒根片发病症状与图5B 相比，发病症状减轻，根片颜色较浅且未出现变软现象，根皮和根片未发生完全分离(图5C)。 说明离体状态下拮抗菌W-5 对花椒根腐病病原菌仍有良好的拮抗效果，与2.3 中的结果一致。

图5 拮抗菌W-5 对花椒根片的离体拮抗作用

2.6 拮抗菌W-5 的分子生物学鉴定和系统发育树构建

采用通用引物对拮抗菌W-5 进行分子生物学鉴定，结果显示:PCR 扩增有效片段的大小为1 480 bp。 对得到的测序结果进行BLAST 比对，选取数据库中与拮抗菌W-5 相近的15 个菌株进行系统发育树构建，发现菌株W-5 与HE659512.1 的亲缘关系最近，同属于枯草芽孢杆菌属，结合其形态特征初步确定拮抗菌W-5 为枯草芽孢杆菌(图6)。

图6 基于16S rDNA 基因构建的拮抗菌W-5 系统发育树

2.7 响应面法优化拮抗菌W-5 发酵条件的参数

2.7.1 拮抗菌W-5 生长曲线绘制与分析 菌株W-5 生长曲线(图7)显示，接种0 ～16 h 之间其生长速率较快，16～22 h 之间生长进入稳定期，22 h 后生长速率逐渐降低，故将拮抗菌W-5 的最佳生长周期确定为22 h。

图7 拮抗菌W-5 生长曲线

2.7.2 拮抗菌W-5 单因素试验结果分析 图8为pH 值、温度、接种量、转速4 个发酵因素对拮抗菌株W-5 生长的影响结果。 pH 值在2.5～10.5之间菌株W-5生长呈现先快后慢的状态；pH值在5.5～9.5 之间菌株生长良好，表明弱碱性条件下其依然具有一定的生长能力，即具有一定的耐碱性；pH 值为7.5 时其OD600达到峰值，因此确定该菌株生长的最佳pH 值为7.5。 温度对菌株生长影响的结果显示:26 ～34 ℃之间菌株均可生长，30 ℃为该菌的最佳生长温度。 接种量在1%～11%之间，该菌生长良好，接种量为3%时其OD600达到峰值，因此确定3%为该菌的最佳接菌量。 摇床上转速在140～220 r/min 之间菌株生长量呈现先升后降的状态，180 r/min 时其OD600达到峰值，因此确定180 r/min 为最佳转速。

图8 不同发酵因素对拮抗菌株W-5 生长的影响

2.7.3 响应面法优化发酵条件结果分析 响应面法试验设计和结果见表2。 通过响应面法获得的方差分析结果(表3)来研究各因素对拮抗菌W-5发酵培养的影响，得出的回归模型为:

表3 响应面试验回归方程方差分析

Y ＝1.94-0.0091A+ 0.0067B + 0.0168C +0.0195D+ 0. 0078AB + 0. 0257AC - 0. 0021AD +0.0544BC- 0.0217BD - 0.0516CD - 0. 2499A2-0.2650B2-0.3046C2-0.2700D2。

由该回归方程分析及方差分析结果可知，回归模型极显著，说明该模型对响应值拟合良好；除AD、AB 项未达到显著水平外，一次项B 对拮抗菌W-5 的OD600具有显著水平，其余一次项、二次项、交互项(AC、BC、BD 和CD)对拮抗菌W-5 的OD600都达到极显著水平，说明其OD600的变化复杂，各试验因素对响应值不是简单的线性关系。说明温度、pH 值、接种量、转速4 个因素对拮抗菌W-5的发酵培养工艺影响显著或极显著。 失拟度0.0601＞0.05，说明试验点均能用该模型描述。 拮抗菌发酵培养工艺模型决定系数为R2＝0.9991，说明模型的相关性很好，并能较好地进行响应值的变化分析，确定最佳发酵条件。 经拟合检验后校正系数R2adj ＝0.9983，两者非常接近，说明拮抗菌发酵培养响应面二次回归拟合度很好。 信噪比Adeq Precision ＝104.3978＞4，说明该模型的试验设计可靠，可信度较高，预测较为准确。 F 值分析结果显示，对拮抗菌W-5 发酵的影响程度:转速＞接种量＞温度＞pH 值。

响应曲面坡度的陡峭与平缓能够直接反映4个因素对OD600的影响，即可以直观地反映出pH值、温度、接种量、转速对拮抗菌W-5 发酵培养的影响。 图9 显示，4 个因素之间的各个响应曲面均为凸型曲面且开口朝下，代表响应值有着极高值，而且曲面坡度都比较陡峭，说明其因子之间交互作用复杂。 各因素之间的交互作用对拮抗菌W-5 发酵培养的影响程度由大到小的顺序为:CD＞BC＞AC＞BD＞AD，其中除AD、AB 项外，其余交互因素对拮抗菌W-5 OD600值的影响均达到极显著水平。

图9 菌株W-5 发酵中不同因素对OD600值影响的响应面图

综合以上试验结果，可将拮抗菌W-5 发酵培养的最佳条件确定为:温度31.3 ℃、pH 值7.5、接种量3.1%、转速180.5 r/min，优化后的OD600值达到1.832。 考虑到生产实际情况及操作的便利性，将该菌的最佳发酵条件修正为:温度31℃、接种量3.0%、pH 值7.5、转速181 r/min。

3 讨论与结论

芽孢杆菌(Bacillusspp.)是自然界广泛存在的重要生物防治微生物资源，植物病害防治中枯草芽孢杆菌(B. subtilis)被广泛应用[18]。 据报道，筛选出的枯草芽孢杆菌对玉米圆斑病、烟草白粉病、水稻稻瘟病、西瓜枯萎病等植物病害均表现出良好的抑菌效果[19-22]。

本试验从花椒根系土壤中分离获得一株对花椒根腐病病原菌腐皮镰刀菌具有良好抑制效果的拮抗细菌，编号W-5，形态学结合分子生物学鉴定其为枯草芽孢杆菌。 研究表明，拮抗菌W-5 对腐皮镰刀菌的抑制率可达82.7%，体视显微镜下观察其对腐皮镰刀菌前端菌丝生长起到抑制作用；结合花椒根片的离体试验结果说明，W-5 对供试5 种病原菌(禾谷镰刀菌、梅毒镰刀菌、藤仓赤霉菌、松针刺盘孢菌和层生镰刀菌)均具有良好的抑菌效果，证实其具有广泛的抑菌活性，可以作为生防菌的优良菌种资源开发利用。 拮抗菌W-5 胞外酶和产嗜铁素能力检测结果说明，该菌能够很好地分泌蛋白酶和纤维素酶，且产嗜铁素的能力极强。 生防菌的生防作用是通过生防菌产生胞外酶来降解病原菌的细胞壁而实现的[23]。微生物产生的嗜铁素能够与病原微生物竞争铁营养，从而达到阻碍病原菌生长即实现生物防治的效果[24]。 以上试验结果表明，枯草芽孢杆菌W-5 在花椒根腐病的防治方面具有良好的开发与应用前景。

采用响应面法优化拮抗菌发酵条件能更好地挖掘其拮抗作用，优化后的发酵体系不但能够提高菌株活菌量，而且能使菌株产生更多的抑菌代谢产物，从而提高生防效果[25]。 本研究以OD600值作为菌株W-5 的考量指标，采用Box-Behnken设计并结合响应面法分析优化菌株的发酵条件，得出:在综合考虑前期试验结果的基础上确定温度31.3 ℃、pH 值7.5、接种量3.1%、转速180.5 r/min为该菌的最佳发酵参数，在此条件下其OD600值可达1.832。 这验证了响应面法对发酵条件优化的可行性。 优化后的发酵体系不但提高此菌的有效活菌数，而且从操作方面可降低发酵成本，可为菌株W-5 开发为微生物菌剂用于花椒根腐病的绿色防治提供一定的理论参考。