偎脓长肉法通过Notch4促进巨噬细胞M2型极化对肛周脓肿术后创面的影响*

夏友光 令狐庆 黄 奚

肛周脓肿是指肛管直肠周围间隙或软组织发生的急性或慢性化脓性感染,多因局限性脓液积聚而引起[1]。流行病学调查显示,肛周脓肿的发病率约为2%,好发于20～40岁的男性,约占肛肠疾病的三分之一[2,3]。目前,手术治疗是肛周脓肿的首选方法,但是术后创面大,加之肛周部属于污染区域,容易导致术后愈合不佳。因此,如何快速促进创面愈合已成为临床研究的热点。

炎症阶段在术后创面愈合中发挥重要作用,炎症可以将巨噬细胞等炎症因子募集于创面,产生生长因子,进而促进新生组织填补创面缺损[4,5]。巨噬细胞可分为促炎型(M1型)和抗炎型(M2型);M1型巨噬细胞在创面的早期阶段会分泌大量的炎症因子,清除坏死组织及病原体,加速创面炎症反应的进程[6];当创面局部炎症反应得到一定控制后,M1型巨噬细胞会转为M2型,起到合成和分泌蛋白质作用,从而促进创面血管新生、组织修复[7]。研究表明,Notch信号通路在调控上皮巨噬细胞募集及血管内皮细胞再生中起着重要作用;同时,Notch信号还是巨噬细胞生物学功能的关键调节器[8,9]。

偎脓长肉法为中医治疗疮面的特色外治法。研究证实,偎脓长肉法通过药疮交互作用,刺激局部细胞因子增殖,从而促进创面肉芽化,加速创面修复[10]。太乙敛疮散是笔者科室根据多年临床经验创制的偎脓长肉外用药,常用于促进肛肠疾病术后创面愈合。有研究显示,偎脓长肉法可以调节M1/M2型巨噬细胞比例,促进创面血管化,加速胶原沉积和创面愈合,但是具体机制尚不明确[11]。本实验拟通过建立肛周脓肿术后大鼠模型,旨在观察偎脓长肉法对术后创面的影响,并探讨其作用是否通过靶向Notch信号调控巨噬细胞来完成。

1 实验材料

1.1 实验动物SD雄性大鼠40只,体质量220～250 g,8周龄,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号:SCXK(沪)2017-0005],饲养于徐州医科大学实验动物中心SPF级动物房,温度22～26 ℃,相对湿度为45%～58%,动物实验操作符合3R原则。实验方案经徐州市中医院实验动物道德伦理委员会批准。

1.2 药物及制备太乙敛疮散由玄参、白芷、当归、赤芍、大黄、生地黄、土鳖虫、血余炭、乳香、没药组成,经物理粉碎加工并过120目筛,通过紫外线灭菌法处理、无菌水调和;所有中药均购自徐州市中医院中药房。龙珠软膏(马应龙)购自徐州市中医院西药房(规格:10 g,批准文号:国药准字 Z10950017,马应龙药业集团股份有限公司)。

1.3 主要试剂与仪器Notch4、Hes1抗体(美国Abcam公司,批号ab95776、ab71559);IL-4、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、CD206 ELISA试剂盒(美国Abcam公司,批号ab100710、ab208348、ab253219、ab281180);苏木精-伊红染色试剂(珠海贝索生物技术有限公司,批号:BA4056);Trizol试剂盒(TaKaRa公司,批号:7233)。

全自动石蜡切片机(金华华速科技有限公司,型号HS3345);Multiskan全波长酶标仪(美国Fermentas公司,型号:MK3);E-Gel Imager凝胶成像仪(美国Thermo Scientific公司,型号:E-Gel Imager)。

2 实验方法

2.1 动物模型的建立和分组采用1.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行麻醉处理,碘伏常规消毒,局部备皮,于大鼠背部形成直径约2 cm的创面伤口,伤口深度直达肌层,止血后在创面滴加大肠埃希菌标准菌株(购自南京便诊生物科技有限公司)0.1 ml,缝合伤口,48 h后拆线,如伤口有脓性分泌物出现即为造模成功。将成功建立的30只大鼠分为模型组、马应龙组、偎脓长肉组,每组10只。另选取10只仅有创面伤口不滴加大肠埃希菌标准菌株的大鼠作为对照组。

2.2 给药所有大鼠均进行常规饲养,每日常规换药。除对照组外,其余各组在每次换药前半小时均需在创面滴加0.1 ml大肠埃希菌标准菌株。对照组和模型组大鼠予无菌生理盐水纱布外敷并固定;马应龙组大鼠创面给予等面积的马应龙完全覆盖创面,其上盖无菌纱布并固定;偎脓长肉组大鼠创面给予等面积的太乙敛疮散完全覆盖创面,其上盖无菌纱布并固定;所有大鼠均每天换药1次,连续干预14 d。

2.3 检测指标

2.3.1 创面愈合情况将造模开始时创面面积作为基础创面面积,每组取3只大鼠,分别于治疗后第3、7、14天测量创面面积,创面愈合率=(基础创面面积-未愈合创面面积)/ 基础创面面积×100%。

2.3.2 苏木精-伊红(HE)染色检测选取治疗后第7、14天各组大鼠愈合创面的组织切片,经脱蜡、水化后行常规HE染色,于光学显微镜下观察创面组织病理学变化情况。

2.3.3 ELISA法检测疗程结束后按IL-4、TNF-α试剂盒说明书检测各组大鼠血清IL-4、TNF-α水平;按iNOS、CD206 ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠愈合创面中iNOS、CD206含量。

2.3.4 蛋白免疫印迹(WB)检测将各组大鼠愈合创面组织进行充分匀浆,加入细胞裂解液后以 12 000 r/min 离心10 min,取上清液测定蛋白量。取待测样品进行SDS-PAGE电泳分离蛋白,并进行转膜、封闭;分别加入一抗(Notch4、Hes1、β-Actin均1∶1000稀释)4 ℃过夜;TBST洗涤3次后加入二抗(以1∶5000稀释)常温孵育2 h,TBST洗脱后曝光显影,拍照后以Image-J软件分析各组蛋白相对表达水平。

2.4 统计学方法所有数据均采用SPSS 22.0软件进行统计分析,符合正态分布资料以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析进行检验,进一步两两比较采用SNK检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 偎脓长肉法对模型大鼠创面愈合率的影响治疗后3 d,各组大鼠创面愈合率之间差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,模型组大鼠在治疗后第7、14天的创面愈合率明显减慢(P<0.05);与模型组相比,偎脓长肉组和马应龙组大鼠创面愈合率明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠创面愈合率比较 (只,

3.2 偎脓长肉法对模型大鼠创面组织病理学的影响HE染色结果提示:治疗7 d后,对照组大鼠创面可见少量瘢痕修复,有肉芽组织形成,大量炎性细胞浸润,可见少量新生毛细血管;模型组大鼠创面组织高度水肿,表层出现坏死,少量肉芽组织形成,大量炎性细胞浸润,成纤维细胞分布稀疏,未见明显新生毛细血管;马应龙组和偎脓长肉组大鼠创面有较多肉芽组织增生,可见血管增生,少量炎性细胞浸润,创面表皮出现增生角化。治疗14 d后,对照组大鼠创面形成较多成纤维细胞和胶原蛋白沉积,存在大量肉芽组织,少量淋巴细胞出现;模型组大鼠创面有少量脓性分泌物,炎性细胞浸润明显,创面表皮结构复杂,层次不轻,可见大量毛细血管和肉芽组织;马应龙组和偎脓长肉组大鼠创面的上皮大部分已基本形成,成纤维细胞肥大且分布密集,胶原组织清晰可见。

3.3 偎脓长肉法对模型大鼠巨噬细胞表达水平的影响与对照组相比,模型组、马应龙组和偎脓长肉组大鼠巨噬细胞中TNF-α、iNOS含量显著升高(P<0.05),而IL-4、CD206含量显著降低(P<0.05);与模型组相比,马应龙组和偎脓长肉组中TNF-α、iNOS含量显降低(P<0.05),而IL-4、CD206含量显著升高(P<0.05)。这提示,偎脓长肉法可促进肺巨噬细胞向M2型极化。见表2。

表2 各组大鼠巨噬细胞表达比较

3.4 偎脓长肉法对模型大鼠创面组织Notch4通路相关蛋白水平的影响与对照组相比,模型组大鼠Notch4、Hes1蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,马应龙组和偎脓长肉组大鼠Notch4、Hes1蛋白表达明显下降(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠创面组织Notch4通路相关蛋白表达比较 (例,

4 讨论

由于肛周脓肿好发于肛管、直肠周围及软组织间隙,术后创面往往较大,加之肛门特殊的生理结构和功能,很容易出现创面污染;如果处置不当,会出现细菌和坏死组织的堆积,导致愈合时间延长[12]。西医针对肛周脓肿术后创面的处理多采用浸有抗感染药物的纱条填塞,辅以敷料固定,但是这种处理方式容易出现二次感染和假性愈合[13]。因此,寻求一种促进肛周脓肿术后创面快速愈合的方法已成为临床研究热点。

偎脓长肉法是中医外科疮疡中特色治疗方法,主要是将中草药敷于创面处,通过局部皮肤和创面组织对药物的吸收,促进局部创面分泌大量脓液,从而达到毒邪外出、腐脱新生的目的。太乙敛疮散是笔者科室根据偎脓长肉法理论创制的院内协定方,在临床多年运用过程中取得了满意疗效。方中白芷活血止痛、生肌排脓;大黄清热解毒、活血祛瘀止痛、通便;血余炭善于止血、生肌补疮;玄参、生地黄均可养阴生津;当归既可补血,又能行血,兼之还可润肠通便,更适合肛周脓肿术后患者;赤芍凉血消肿、散瘀止痛;土鳖虫破血逐瘀止痛;乳香、没药均可活血止痛、生肌。诸药合用,可奏去腐生肌之功。本研究结果显示,治疗干预后第7、14天,偎脓长肉组大鼠创面愈合率明显高于模型组和马应龙组,提示偎脓长肉法可以有效促进肛周脓肿术后创面愈合速度。HE染色结果显示,应用太乙敛疮散后,肛周脓肿术后大鼠创面中成纤维细胞和肉芽组织的数目明显增多,且有大量血管增生和胶原蛋白沉积,表明偎脓长肉法可以增加肛周脓肿术后创面中胶原重塑和表皮生长速度,从而加速伤口的愈合。

炎症阶段在术后创面恢复中起着重要作用。正常状态下,炎症可以将巨噬细胞募集到创面,清除细胞碎片、分泌生长因子、促进基质沉积和重建,从而加速创面愈合[5]。但是在病理情况下,缺乏相应的炎症细胞,特别是巨噬细胞,会导致创面难以愈合。巨噬细胞的功能主要有诱导炎症和组织再生,前者由M1型巨噬细胞发挥作用,后者由M2型巨噬细胞执行[14]。研究表明,TNF-α、iNOS可用于鉴定M1型巨噬细胞,而IL-4、CD206则是鉴定M2型巨噬细胞较为理想的指标[15]。本研究中,在太乙敛疮散干预后,TNF-α、iNOS含量显降低,而IL-4、CD206含量显著升高,这表明,偎脓长肉法可以诱导肛周脓肿术后模型大鼠巨噬细胞向M2型极化,进而抑制创面炎症的进展。

巨噬细胞的极化和功能调节涉及到多种信号通路和转录网络的调节[16]。有研究报道,Notch信号是巨噬细胞生物学功能的关键调节器,阻断Notch信号通路有助于巨噬细胞向M2型极化[17]。另有研究显示,Notch4靶基因Hes1的激活会促进巨噬细胞的激活,加重炎症反应,减少向M2型极化[18]。Huang等[18]发现,Notch4及其配体在糖尿病溃疡小鼠创面中呈现高表达;而给予Notch4抑制剂或敲除Notch4基因后,可加快小鼠溃疡面的愈合速度。由此推测,Notch4信号通路在创面愈合过程中有着重要作用。本研究结果显示,经太乙敛疮散干预后,偎脓长肉组大鼠的Notch4、Hes1蛋白表达明显降低,提示偎脓长肉法可以抑制Notch4通路活化。推测偎脓长肉法可能通过抑制Notch4信号通过促进巨噬细胞的M2型极化作用。

综上所述,偎脓长肉法可以促进肛周脓肿术后大鼠的创面愈合率,调控炎症因子的释放,增加创面的成纤维细胞数目和胶原组织沉积,加速术后创面的愈合。其作用机制可能与调控Notch4信号通路,从而诱导巨噬细胞向M2型极化有关。然而本研究仅初步探讨了偎脓长肉法对巨噬细胞极化的影响,后续尚需要体外细胞研究和在体动物的双向验证研究。