二甲双胍对糖尿病大鼠创面肌成纤维细胞纤维化的影响及其机制研究

王治兵，赵天琪，王宝宏，董俭达，侯绍章

（宁夏医科大学基础医学院病理学系，银川 750004）

糖尿病是一种以血糖水平增高为特征的代谢紊乱性疾病，伴有心血管疾病、肾病、视网膜病、糖尿病性溃疡等并发症[1]。其中，糖尿病性溃疡患者长期受高血糖的影响，导致创面迁延不愈，常发展为足部和下肢的慢性溃疡，更有甚者需要进行截肢手术[2]。有研究[3]表明，血糖控制不佳、晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）沉积、氧化应激等因素均可导致糖尿病创面难愈。二甲双胍是一线抗糖尿病药物，有研究[4]发现，其通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）促进糖尿病创面愈合。还有研究[5]表明，二甲双胍可改善糖尿病大鼠急性创面延迟愈合和再上皮化障碍等问题。在高糖条件下，位于创面处的肌成纤维细胞（myofibroblast，Myo F）的AMPK 表达降低，二甲双胍可上调高糖条件下的AMPK 表达，具体作用机制仍不清楚。肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）通过促进AMPKα 亚基Thr172 位点的磷酸化来增强AMPK 磷酸化，LKB1/AMPK 信号通路在调节细胞代谢、生存、增殖、应对营养和能量需求改变等方面起着核心作用[6-7]。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是较为常见的炎性因子，可以直接参与组织修复。有研究[8]发现，AMPK 可以抑制TGF-β1、血管紧张素及醛固酮诱导的上皮间质转化（epithelial -mesenchymal transition，EMT）过程，但可以促进间质上皮转化（mesenchymal epithelial transition ，MET）。α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是Myo F 的重要标志蛋白，与组织细胞的纤维化存在正相关关系[9]。因此，通过探究二甲双胍影响糖尿病急性创面区成纤维细胞而改善糖尿病急性创面的愈合，可以为糖尿病创面治疗提供潜在的靶点。

1 资料与方法

1.1 材料及仪器

健康雄性SD 大鼠18 只，体质量为150～160 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供［SPF 级，合格证编号：SCXK（N）2015-0001］。链脲佐菌素（STZ，美国Sigma 公司），盐酸二甲双胍肠溶片（中国天安药业股份有限公司），皮肤取样器（皮肤环钻，直径5 mm，美国Acuderm 公司），α-SMA （中国Affinity 公司）、LKB1（中国Proteintech 公司）、TGF-β1（中国Affinity 公司），TGF-β1 抗体（中国Affinity 公司），苏木素-伊红试剂（中国北京雷根生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型制备 将18 只雄性SD大鼠随机分为3 组，即正常血糖对照（normal control，NC）组、糖尿病对照（diabetic control，DC）组及糖尿病二甲双胍干预（diabeitic metformin intervention，DM）组，每组6 只。室内温度为22～25 ℃，相对湿度为50%～60%，光照与黑暗时间各12 h，大鼠分笼饲养，自由饮食，适应性喂养1 周后开展实验。所有实验均符合宁夏医科大学动物实验伦理标准。将3 组实验动物禁食12～24 h后，采用尾静脉取血的方式进行血糖检测。其中，DM 组和DC 组分别以65 mg·kg-1剂量腹腔注射10% STZ（由pH 为4.6 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制），注射后1 周内，每天观察并测量实验动物的体质量、食入量、毛色及活动情况，测定每组大鼠的尾静脉血糖，将空腹血糖＞16.7 mmol·L-1作为糖尿病大鼠模型构建成功的判定标准。

1.2.2 创面制备 将各组大鼠常规消毒，使用王宝宏等发明的动物皮肤创面制备装置（专利证书号：10032087），在每只大鼠背部脊柱两侧制备直径为5 mm 的圆形全层皮肤创面，每侧2 个创面，共4 个创面。无菌环境下，将二甲双胍粉末与医用凡士林1∶2 混合配制成二甲双胍凡士林霜剂，于4 ℃条件下保存。制备好创面后，DM 组大鼠创面1 cm×1 cm 区域涂二甲双胍凡士林霜剂，每天1 次，NC 组和DC 组不做处理。于实验第3、6、9 天分别麻醉每组2 只大鼠并收集创面及创面周围1 cm×1 cm 区域的皮肤，每组8 个创面，创面组织沿最大直径切开，一半创面固定于4%甲醛溶液中，组织经梯度乙醇脱水、浸蜡和石蜡包埋后，连续切4 μm 厚的切片进行组织形态学观察，另一半创面组织于-80 ℃保存。

1.2.3 Western blot 每100 mg 皮肤组织加入500 μL 裂解液，于冰上充分振荡混匀，4 °C 冰箱中放置30 min，经研磨仪研磨，4 °C 离心机离心后取上清，测定蛋白浓度，制成上样缓冲液。用8% SDS-PAGE 凝胶进行电泳（80 V/120 V）。于4 °C 条件下，300 mA 条件下转膜。转膜结束后，用5%脱脂牛奶溶液室温封闭2 h，TBST 清洗3次，分别加入相对应的一抗（稀释比例1∶1 000），4 °C 孵育过夜。次日复温30 min，用TBST 洗膜3 次，加入二抗（稀释比例1∶3 000），室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次，用ECL 化学发光液显影，使用软件Image J 进行灰度值分析，以GAPDH 为内参，计算蛋白的相对表达量。

1.2.4 免疫组化 石蜡切片脱蜡至水，用pH 为6.0 的0.01 mol·L-1柠檬酸钠缓冲液进行高温抗原修复10 min 后冷却至室温，0.3% H2O2孵育15 min，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS 冲洗3 次，山羊血清于室温下封闭1 h，滴加一抗工作液4 °C 孵育过夜。次日复温1 h，PBS 洗3次，滴加反应增强液在37 °C 温箱孵育20 min，PBS 冲洗3 次，加入二抗工作液室温孵育1 h，PBS 洗涤3 次。避光滴加DAB 显色液，观察有棕黄色产物出现并不再变色后终止反应，切片由Motic 数字切片系统扫描，利用Image J 软件分析阳性表达强度[10]。

1.3 统计学方法

所有实验数据均采用SPSS 23.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用多个独立样本非参数检验。P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体质量及血糖

实验前，各组大鼠体质量和血糖差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。糖尿病模型制备后，与NC组大鼠比较，DC 组和DM 组大鼠出现多饮、多食、多尿及体质量减轻，毛色无光泽，活动度降低。与NC 组比较，DC 组和DM 组大鼠的体质量降低，尾静脉血糖升高（P 均＜0.05）。与DC 组比较，DM 组体质量和血糖的差异均无统计学意义（P 均＞0.05），见图1。在创面愈合前后，NC 组大鼠体质量均高于DC 组与DM 组（P 均＜0.05）；NC组大鼠血糖均低于DC 组与DM 组（P 均＜0.05），见图2。

图1 大鼠造模前后体质量及血糖比较

图2 大鼠创面愈合前后体质量及血糖比较

2.2 LKB1 在各组大鼠皮肤表皮中的表达

免疫组化染色和Western blot 实验检测LKB1 在糖尿病大鼠中的创面愈合结果显示，与NC 组比较，DC 组大鼠创周皮肤及创面角质形成细胞（KCs）中LKB1 表达降低（P 均＜0.05），且DC组大鼠在第3、6、9 天创周皮肤角质形成中LKB1的表达变化较小；在DC 组中，创面KCs 中LKB1的表达量在第3 天最低，第6、9 天，DC 组大鼠创面KCs 中LKB1 的表达量降低（P 均＜0.05）；经二甲双胍治疗后，糖尿病大鼠创周及创面皮肤KCs 中LKB1 的表达量增高（P 均＜0.05），见图3～图5。

图3 各组大鼠创周组织LKB1 免疫组织化学染色

图4 各组大鼠创面组织LKB1 免疫组织化学染色

图5 各组大鼠皮肤组织中创周与创面的LKB1 的表达

2.3 TGF-β1 在各组大鼠皮肤Myo F 中的表达

免疫组化染色和Western blot 实验检测TGF-β1 在各组大鼠皮肤Myo F 中的表达结果显示，在NC 组创面愈合过程中，创面愈合第3、6天，Myo F 中TGF-β1 的表达降低并低于创周组织；创面愈合第9 天，创面Myo F 中TGF-β1 的表达增高，其表达量接近于创周Myo F；与NC 组比较，DC 组大鼠创面及创周Myo F 中TGF-β1的表达增高（P＜0.05）；与DC 组比较，DM 组大鼠创面及创周Myo F 中TGF-β1 的表达均降低（P均＜0.05），见图6、图7、图8。

图6 各组大鼠创周组织TGF-β1 免疫组织化学染色

2.4 α-SMA 在各组大鼠皮肤Myo F 中的表达

免疫组化染色和Western blot 检测α-SMA在各组大鼠皮肤Myo F 中的表达结果显示，与NC 组比较，DC 组大鼠创周Myo F 中α-SMA 的表达增高（P＜0.05）；与DC 组比较，DM 组大鼠创周Myo F 中，α-SMA 的表达降低（P＜0.05）。在NC 组大鼠创面Myo F 中，α-SMA 的表达随着创面愈合过程逐渐上调；但与NC 组比较，在第3、6、9 天，DC 组大鼠创面Myo F 中α-SMA 的表达量增高（P＜0.05）；与DC 组比较，DM 组大鼠创面Myo F 中，α-SMA 的表达量降低（P＜0.05），见图9、图10、图11。

图9 各组大鼠创周组织α-SMA 免疫组织化学染色

图10 各组大鼠创面组织α-SMA 免疫组织化学染色

图11 各组大鼠皮肤组织中创周和创面的α-SMA 表达

3 讨论

糖尿病患者，皮肤损伤后愈合延迟是糖尿病创面的重要临床特点。糖尿病创面的修复愈合延迟主要表现为氧化应激增强、炎症消退延迟等[9]。糖尿病创面的新兴治疗方法主要包括自体皮肤移植、负压吸引和光子治疗等，但是其有效性和安全性一直存在争议。

糖尿病难愈性创面的形成是多因素、多环节参与的复杂病理过程。在糖尿病创面持续的高糖环境下导致AGEs 蓄积，从而导致糖尿病皮肤创面组织细胞功能紊乱[10]。创面愈合主要在Myo F、KCs 及炎性细胞等多种细胞以及细胞，外基质、细胞因子等共同参与并相互调控下完成[11]。AMPK是调节能量稳态的重要激酶，参与多种信号传导通路的关键蛋白。AMPK 被激活后能够直接调节葡萄糖的代谢。在创面修复的过程中，Myo F 通过增殖、分化和迁移形成新的组织结构，参与完成创面愈合过程[12-13]。有研究[14]表明，AMPK 被激活后会抑制Myo F 生长及相关蛋白合成，创面愈合过程中，NC、DC 及DM 组大鼠的RE 区AMPKα 的表达均下调，提示AMPK 可能参与皮肤的损伤修复，AMPK 表达的下调可能会促进Myo F增殖和相关蛋白的合成。同时，有研究[15]也显示，Myo F 的成熟分化与AMPK 的表达上调呈正相关。

Myo F 是指含有肌动蛋白、肌球蛋白和其他肌肉蛋白的成纤维样细胞，是由成纤维细胞转化而来，具有活跃的增殖和分泌胶原的能力，是细胞外基质的主要来源。α-SMA 是Myo F 细胞的重要标志蛋白，参与纤维化形成[16]。有研究[17-18]提出，成纤维细胞转化为Myo F 后，具有产生胶原纤维的功能，促使肾间质等发生纤维化。本研究结果显示，在创面愈合过程中，NC 组创面组织有α-SMA 表达，这是由于创面修复过程中有肉芽组织形成，成纤维细胞分泌大量的胶原蛋白，并且向Myo F 转化，后者可以表达α-SMA，实验第9 天时，DC 组的α-SMA 蛋白表达量高于NC 组，而DM 组的α-SMA 蛋白表达量低于DC 组。提示高糖环境促进Myo F 标志蛋白α-SMA 的表达，导致细胞外基质的增加，促使组织纤维化的发生，当二甲双胍干预后，α-SMA 的表达降低，促进了EMT 过程从而有利于创面愈合。这与Berlanga-Acosta 等[19]的研究结果一致，二甲双胍通过减少包括α-SMA 在内的相关蛋白的表达，抑制EMT 过程，从而改善了肝纤维化。也有研究[20]认为，在高糖环境下，皮肤组织中Myo F 分泌胶原蛋白能力增加，导致创面愈合迟缓。

LKB1 基因的编码产物LKB1 蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，调节多种细胞生理病理过程。LKB1 促进AMPKα 亚基上的Thr172 位点磷酸化来提高AMPK 的磷酸化水平，被激活后的AMPK可以部分介导上皮细胞紧密连接的组合和分解[21]。LKB1/AMPK 信号通路在调节细胞代谢等及应对营养和能量的需求中发挥着核心作用[6-7]。有报道[22]表明，AMPK 可以调节紧密连接的形成。结合本研究及本课题组之前的实验，降糖药二甲双胍可以作为AMPK 的激活剂已被证实，DC 组大鼠RE 区LKB1 的表达低于NC 组和DM 组，AMPK 的表达也低于NC 组和DM 组，细胞间紧密连接增加，外用二甲双胍可以上调糖尿病大鼠LKB1 和AMPK 的表达，这提示二甲双胍对创面皮肤愈合过程有潜在的促进作用。TGF-β1 是一种重要的细胞因子，与许多纤维化疾病的发病机制相关，TGF-β1 能参与细胞的生长、分化，也可以直接参与组织修复等，能够促进成纤维细胞、成骨细胞的生长[23-24]。本研究显示，DC 组TGF-β1的表达高于NC 组，提示糖尿病大鼠上调TGFβ1 在皮肤组织的表达，且AMPKα 的表达与TGF-β1 水平均呈负相关性。与DC 组大鼠相比，DM 组大鼠TGF-β1 表达降低，这些结果表明，AMPK 抑制TGF-β1 的表达。有研究[8]发现，AMPK可以抑制血管紧张素、醛固酮及TGF-β 诱导的EMT 过程，同时促进MET 过程。TGF-β 及Smad信号通路通过介导足细胞损伤、EMT 及肾细胞凋亡等最终导致肾小球硬化及肾间质纤维化[25]，但是在皮肤组织中，还需要进一步验证。以上结果表明，升高的AMPK 上游激酶LKB1 会抑制TGF -β1 的转录活性，激活AMPK 也会抑制TGF-β1 的活性，二甲双胍上调糖尿病大鼠皮肤组织AMPK 的表达，下调TGF-β1 和α-SMA 的表达，从而促进糖尿病大鼠创面愈合。综上所述，二甲双胍可以下调糖尿病大鼠创面组织成纤维细胞的纤维化而促进其愈合。