牛蒡根果蔬复合酵素的研发

韩欣悦，胡晓晴，刘 强，樊 宇，江思雨，陈红玲

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州 234000）

牛蒡（Arctium lappaL.），又名大力子、东洋参，是菊科牛蒡属直根系二年生草本植物[1]，在世界各地方均有种植，并且在我国已有近2 000 年的种植史，分布于江苏、安徽、黑龙江、山东等地区，其中在江苏徐州丰县、沛县和山东兰陵县种植历史最悠久，面积规模最大。作为我国传统中药，其果实、根和叶均可作为药用，现已被世界公认为保健食品。牛蒡根中含有丰富的多糖、酚类物质、蛋白质[2]、氨基酸、维生素，以及钙、锌、磷、铁等多种人体所需的营养物质和矿物质。已有研究表明，牛蒡根具有抗氧化、抗炎、调节神经、降糖降脂、调节免疫[3]等作用，鉴于其丰富的药理活性，有研究报道了不同基因型牛蒡根中咖啡酰奎宁酸和木脂素的定量分析结果，并对其抗氧化活性进行了研究，开发了具有较强抗氧化活性和良好色泽的牛蒡根茶，对焙烧效果进行了测定，该试验为后续对牛蒡根的研究提供了理论支持[4]。

近年来，随着酵素产品应用市场的扩展[5]，消费者逐渐认识到酵素的营养价值。研究表明[2]，酵素中含有丰富的维生素类、氨基酸和酚类、黄酮苷类化合物、矿物质、功效性低聚糖和功效酶等多种功能性成分，部分研究报道也表明酵素有抑菌消炎、抗衰、优化体内环境、抗癌、净化血液、调节免疫、修复机体损伤等方面的药物活性。因此，若能开发出一种牛蒡（主要原料） 与酵素结合的[7]具有保健功能的新型产品[6]，不仅能够进一步综合产品的保健性能，还能拓展牛蒡类休闲食品的范畴，提高对牛蒡植物的资源利用。

通过对牛蒡根（主要原料） 复合山药、火龙果、葡萄、苹果、柠檬等果蔬进行试验[7]。以米曲霉（Aspergillus oryzae）[8]为发酵菌种，进行人工发酵处理，合理调整发酵过程，减少发酵周期以制备牛蒡根复合果蔬酵素。以pH 值、糖度、酒精度、菌落数、大肠杆菌数（Number ofEscherichia coli）、致病菌数作为评价指标，通过单因素方差试验分析（ANOVA）[10]和Box-behnken 响应曲面试验[11]设计完善发酵条件，整合最优发酵条件组合，为牛蒡根复合果蔬酵素的综合性研发提供一定理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛蒡（Arctium lappaL.） 品种为柳川理想，购自江苏省徐州市丰县；土豆、山药、火龙果、葡萄、苹果、柠檬、枸杞等，均购自当地市场；米曲霉（Aspergillus oryzae≥90%），上海麦克林生化科技有限公司提供；食品级二氧化氯（ClO2），辽宁众发生物科技有限公司提供；食品级柠檬酸，河南万海化工产品有限公司提供；异抗坏血酸钠，济南鲁辉化工有限公司提供；葡萄糖（C6H12O6），天津市致远化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

FA2004 型电子天平，山东潍坊盛翔试验设备有限公司产品；BBS-SSC 型超净工作台，山东博科生物产业有限公司产品；JJ-2 型组织捣碎机，安庆结佳仪器设备有限公司产品；SHA-C 型水浴恒温振荡器，常州润华电器有限公司产品；TGL-20B 型离心机，上海双旭电子有限公司产品；JX-24 型打浆机，福州金翔食品机械设备有限公司产品；DSX-24L-1型高压蒸汽灭菌器，四川高能科迪仪器有限公司产品；UV752 型紫外- 可见分光光度计，山东欧莱博医疗器械有限公司产品；PB-10 型标准型pH 计，广东正一实验设备有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

①制备米曲霉菌。参考文献[13]第二章、第三章进行米曲霉菌的分离筛选；

②新鲜牛蒡→低温贮存→切除保鲜头→清洗去皮→杀菌→糖化→去表皮→碎裂→浸渍；

③复合果蔬（山药、火龙果、苹果等） →清洗去皮→杀菌→去表皮→切块→打浆；

④紫皮葡萄→清洗→杀菌→去表皮→捣碎；

①+②+③+④→混合搅拌均匀→密封发酵→牛蒡根果蔬复合酵素。

1.3.2 试验方法

（1） 将新鲜牛蒡在置于-5 ℃恒温中贮存2 d 以上，将贮存后的牛蒡在超净工作台上切除保鲜头、清洗去皮、在杀菌液75%乙醇溶液中杀菌3 h 后，将其放在糖化库内糖化70 d，糖化过的牛蒡去表皮，去皮的厚度为0.3～0.5 mm，将去皮过的牛蒡用粉碎机碎裂，按牛蒡的质量分数加入25%白砂糖，15%护色液，护色液由（质量百分比） 柠檬酸0.02%～0.10%，氯化钙0.5%～1.5%、食盐0.5%～0.8%和余量的水配制而成，均匀搅拌，用200 目过滤网过滤，在25 ℃条件下恒温80 min。

（2） 将复合果蔬（山药、火龙果、苹果等） 分别在超净工作台上清洗去皮，在杀菌液中杀菌1 h后去表皮、切块、打浆，打浆温度控制在7～9 ℃，打浆速度为600～700 r/min，打浆时每隔1 min 加入各质量分数15%的护色液。

（3） 将紫皮葡萄在超净工作台上清新干净后，在杀菌液中杀菌30 min 后去皮捣碎备用。

（4） 将碎牛蒡、复合果蔬（山药、火龙果、苹果等） 分别混合，然后加入备用的按混合物总质量分数的6%紫皮葡萄后放入密封发酵玻璃罐，于20～30 ℃恒温箱中发酵45～55 d，pH 值稳定在3.0～3.5 即判断发酵结束。

1.3.3 样品液的制备

在整个发酵过程中，每隔8 d 取样一次进行相关指标测定。样品的制备：取20 mL 酵素原液（发酵罐内发酵物分层，上层为发酵果肉残渣，中层液体为酵素） 以转速3 500 r/min 离心10 min，取上清液得到样品。

1.3.4 理化指标测定

pH 值测定，参考文献[14]中pH 计测定方法；糖度测定，参考文献[15]中糖度计折光仪测定方法；酒精度测定，参考文献[16]中酒度计测定方法。

1.3.5 微生物指标测定

菌落总数测定：参考文献[17]中GB 4789.2—2010 菌落总数测定方法；大肠杆菌群数测定：参考文献[18]中GB 2789.3—2010 大肠杆菌群数测定方法；致病菌数测定：参考文献[19]中GB 4789.15—2010 致病菌数测定方法。

1.3.6 感官评分标准

试验中由10 位具有专业知识的教师感官鉴评，小组根据试验结果进行感官鉴定。

牛蒡根果蔬复合酵素的感官评分见表1。

表1 牛蒡根果蔬复合酵素的感官评分

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析[23]

2.1.1 发酵温度对果蔬复合酵素感官评分的影响

发酵温度对果蔬复合酵素感官评分的影响见图1。

图1 发酵温度对果蔬复合酵素感官评分的影响

由图1 可知，随着发酵温度的升高，果蔬复合酵素的评分呈现先上升再下降的趋势。因为发酵温度过低，微生物代谢缓慢；发酵温度过高，米曲霉菌的活性受到抑制；当发酵温度为25 ℃时，评分最高，即果蔬复合酵素的最适发酵温度为25 ℃时口感最佳。

2.1.2 发酵时间对果蔬复合酵素感官评分的影响

发酵时间对果蔬复合酵素感官评分的影响见图2。

图2 发酵时间对果蔬复合酵素感官评分的影响

由图2 可知，随着酵素发酵时间的延长，果蔬复合酵素的评分呈现先上升后下降的趋势。因为由于发酵时间的延长，米曲霉菌的种类和数量不断减少，发酵过程接近终止。当发酵时间为50 d 时，评分最高，即果蔬复合酵素的最适发酵时间为50 d 时香味浓郁醇厚。

2.1.3 米曲霉菌种接种量对果蔬复合酵素感官评分的影响

米曲霉菌种接种量对果蔬复合酵素感官评分的影响见图3。

图3 米曲霉菌种接种量对果蔬复合酵素感官评分的影响

由图3 可知，随着米曲霉菌种接种量的增加，果蔬复合酵素的评分呈现先上升再下降的趋势，在菌种接种量为2%时，评分最高，即果蔬复合酵素加入的最适米曲霉菌种量为2%时发酵最好。

2.1.4 紫皮葡萄添加量对果蔬复合酵素感官评分的影响

紫皮葡萄添加量对果蔬复合酵素感官评分的影响见图4。

图4 紫皮葡萄添加量对果蔬复合酵素感官评分的影响

由图4 可知，随着加入紫皮葡萄量的增加，果蔬复合酵素的评分呈现先增加后下降的趋势。在紫皮葡萄添加量为6%时，评分最高，即果蔬复合酵素中最适紫皮葡萄量为6%时口感细腻爽滑。

2.2 正交试验分析

根据单因素试验结果分析，选取发酵温度、发酵时间、菌种接种量、紫皮葡萄添加量对感官评分的影响进行正交试验分析。

正交试验分析结果见表2。

表2 正交试验分析结果

由表2 可知，各因素对果蔬复合酵素品质和风味的影响主次顺序为D＞C＞A＞B，通过正交试验结果分析可知，果蔬复合酵素研发的最优配方组合为A3B2C3D2，此时产品的感官评分为90.25 分，即最适发酵温度为25 ℃，发酵时间为50 d，米曲霉菌种接种量为2%，紫皮葡萄添加量为6%。

2.3 产品品质检测结果

2.3.1 感官指标

色泽有泽感，澄清透亮；风味，浓郁清香；口感，清新爽口，口感细腻；澄清度，均匀透明，无可见杂质；质地，富有弹性。

2.3.2 理化指标测定

pH 值小于4，糖度小于600 mg/mL，酒精度小于0.50/100 g，符合酵素理化指标检测要求。

2.3.3 微生物指标

经检测，细菌总数小于100 CFU/g，大肠菌群小于3 MPN/100 g，致病菌未检出，符合酵素微生物指标检测要求。

3 结论

通过试验分析可知，牛蒡根果蔬复合酵素的最佳工艺参数为发酵温度25 ℃，发酵时间50 d，米曲霉菌接种量2%，紫皮葡萄添加量6%。在此生产工艺下的酵素产品口感清新爽口、口味最佳，更进一步综合性发挥酵素产品的保健性能。