猪乳外泌体中miRNA对猪繁殖与呼吸综合征的防御作用

奚德鑫，付诗涵，蔡锦顺

（ 延边大学农学院，吉林 延吉 133000 ）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种接触性传染病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，俗称蓝耳病。PRRS是一种可导致母猪生育能力下降以及仔猪的呼吸道发生病变等一系列恶性结果的高危传染病，特征表现是高发病率和死亡率、高热、高病毒血症以及与其他细菌的合并感染，一旦发病很难治愈，可对养猪业的经济发展产生严重影响。PRRSV的遗传多样性非常高，且这种多样性可能对疫苗的开发产生严重影响，开发更新和普遍有效的PRRSV 疫苗具有挑战性[1]。目前分离到的PRRSV 分为美洲型和欧洲型两种，近年来我国研究者在本土分离到的PRRSV绝大多数为美洲型，只有极少数的欧洲型[2]。猪的呼吸道是PRRSV的主要入侵部位，猪群的接触、繁育等是导致PRRS传播的主要行为，被污染的猪舍、器械和染病的猪等是PRRS 的主要传染源，此外，仔猪对PRRSV 比成猪更易感。大量研究表明，断奶仔猪感染PRRS 的概率显著高于成猪和哺乳期仔猪，因而推测是母乳中的一些成分抑制了PRRSV的繁殖。本课题组经过前期大量的资料查询及总结，发现母乳中存在一部分外泌体，外泌体包裹着大量的miRNA，而有些miRNA又会通过某些通路释放信号，给细胞一定刺激使其作出反应，进而促进或抑制病毒复制，由此推测可能是母乳中外泌体内的miRNA 发挥了作用抑制了PRRSV 的复制，但目前仍缺乏相关研究。基于此，文章论述了PRRSV的致病机制及预防研究进展，总结了外泌体中miRNA 的作用机制及对PRRSV 的作用，为后续猪乳外泌体分离检测以及筛选出相关miRNA、推进后续PRRS疫苗研发提供参考。

1 PRRSV致病机制及预防研究进展

1.1 PRRSV

PRRSV 是一种具有包膜的单链阳性RNA 病毒，高度局限于单核细胞或巨噬细胞谱系的细胞，如猪肺泡巨噬细胞（PAM）。由PRRSV 引起的PRRS 是猪中最严重的传染病之一，该疾病的特征是母猪繁殖失败和呼吸系统问题。由于病毒侵入免疫细胞后会破坏免疫系统，导致免疫抑制，发生继发性细菌感染，并干扰其他商业疫苗对猪圆环病毒和经典猪瘟病毒的免疫保护作用。而且，在感染PRRSV的猪中还观察到长期病毒血症（＞30 d）和抗体依赖性增强现象。PRRSV 通过一系列机制损害猪肺部的局部免疫反应，包括黏膜纤毛转运系统受损，PAMs的功能和数量减少，诱导免疫细胞凋亡以及造成促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的不平衡，可能使病毒在宿主中持续存在。PRRSV还可降低巨噬细胞的杀菌活性，导致对继发感染的易感性上升[3]。受感染的猪会产生强烈且快速的体液反应，但这些初始抗体不能提供保护，甚至可能通过介导抗体依赖性增强疾病而对机体有害。相反，中和抗体（NA）的发育被延迟，细胞介导的免疫反应产生最初是不稳定的，如PRRSV 特异性干扰素（IFN-γ）分泌细胞。尽管如此，有效接种疫苗似乎需要诱导强而快速的NA 和IFN-γ反应。PRRSV 可调节宿主的免疫反应，抑制关键细胞因子，如干扰素-α（IFN-α）；并可能诱导调节细胞因子，如白细胞介素-10（IL-10）。NAC 的发育似乎因糖蛋白5 中存在靠近主要中和表位的诱饵表位而受到损害。这种调节宿主免疫反应的能力可能因菌株或分离株而异。

1.2 PRRS的预防相关研究进展

目前，商业疫苗（改良活疫苗）是效果良好，但其无法诱导高水平的中和抗体，因此不能提供有效的保护，防止PRRSV 感染。此外，这些疫苗还存在其他缺陷，如长期病毒血症、易与田间菌株重组等。因此，为更好地预防和控制PRRS，还需进一步研究PRRSV的致病机制。以miRNA介导而生产的PRRS 疫苗经过大量的研究得到了认证，这种新型疫苗将为PRRS的预防和治疗起到关键性作用。

miRNA主要参与调控基因表达，使基因沉默。有研究利用miRNA 沉默技术作为弱化疫苗毒性的一种补充，miRNA 反应原件（MREs）掺入病毒核蛋白质的开放性读码框中，由miRNA介导的基因沉默可弱化病毒活性，产生减毒活疫苗的重配株。经过大量试验证明，由miRNA 介导的基因沉默新方法弱化的疫苗比传统方法生产的疫苗活性更弱，安全性更高。我国目前仍采用以传统疫苗为主的病毒防治措施，但由于灭活疫苗不能长期抵御PRRSV的侵袭，因而加快开发和生产非常迫切，而且生物技术疫苗和佐剂等研究也是工作的重点[4]。其中活疫苗预防效果比较好，缺点是缺少交叉保护能力；灭活苗与其他疫苗相比最为安全，但能力不强，不易起效；亚单位疫苗优点是妊娠母猪可注射；DNA疫苗可与活疫苗联合注射以加强预防效果；载体疫苗目前尚未投入市场[5]。综上所述，现阶段我国尚无一种疫苗可以针对性地预防PRRS，只能通过科学技术手段配合疫苗定向使用。RT-PCR检测技术和ELISA检测是目前检测PRRSV的主要技术手段，RT-PCR检测技术可检测毒株类型，ELISA检测技术则可测出注射疫苗的效果以及宿主体内病毒的情况。

林德锐等[6]研究发现，采用肌肉注射与喷鼻接种的方法，不论是单独接种猪瘟活疫苗还是同时接种猪瘟活疫苗和HP-PRRSV活疫苗，接种后免疫效果无明显差异。丁尊俄等[7]发现，弱毒疫苗和灭活疫苗联合免疫的效果明显优于单独免疫。刘欢欢等[8]发现，PRRS弱毒活疫苗除了可以抑制PRRSV，还可以减少产生病毒血症的数量和持续时间，减轻呼吸系统疾病和繁殖障碍。王俊等[9]研究发现，低剂量的VLPs 疫苗比最大剂量弱毒苗的免疫效果好，且两者中和抗体的产生量只有细微差别，因此VLPs 疫苗也是一种既安全又高效的预防PRRSV的疫苗。苏玮玮等[10]发现，微载体悬浮培养技术在HP-PRRSV活疫苗工业化生产及产品质量控制方面具有显著的优势。刘晓东等[11]研究发现，高致病性PRRSV弱毒疫苗非常安全，对母猪进行普免后不会引发不良反应，并且适用于所有猪群。张洪亮等[12]发现，高致病性PRRSV 活疫苗对类NADC30 PRRSV可提供一定的交叉保护。李少丽等[13]研究发现，PRRS 灭活疫苗的加强免疫，尤其与同源性更高的PRRS 二价灭活疫苗联合免疫，可加速试验猪体内排毒、提高猪的日增重。但需要注意，在对患病猪进行第一次PRRS 疫苗接种时应做好安全试验工作，避免出现不良反应[14]。

控制和根除PRRS是一个世界性问题。解决病毒的发病机制和病毒-宿主相互作用的机制至关重要，是预防和控制病毒的关键前提和基础。由于PRRSV感染导致猪的免疫抑制，因此很难开发出理想的疫苗产生高水平的中和抗体。利用CRISPR/Cas9技术育种抗病猪、开发抗病毒分子可能是PRRS 防治的重要方向[15]。Xu 等[16]研究发现，PRRSV-ADE 感染显著增加了线粒体呼吸链复合物的表达，并干扰了先天免疫信号、抗病毒蛋白、泛素-蛋白酶体系统和核糖体的功能，这些发现为阐明PRRSV-ADE感染的机制、筛选治疗ADE 感染的新靶点以及开发新型PRRSV疫苗提供了新方向。PRRSV减毒疫苗株作为一种单链RNA 病毒，可在猪体内表达外源蛋白并诱导强烈的免疫反应。Li等[17]研究建立了mAb，可以作为评估重组病毒中p17表达水平的有用工具。此外，间接ELISA方法在特异性和有效检测重组病毒体内抗体水平方面具有巨大潜力，对未来PRRSV的疫苗研究具有重要意义。

2 外泌体中miRNA的作用机制及对PRRSV的作用

2.1 miRNA对病毒的作用机制

在经过查阅大量相关资料发现，miRNA 是高度保守、长度很短的非编码单链核苷酸，miRNA在转录后基因表达调节中起到重要作用，还可以调节病毒与宿主间的相互作用。病毒在侵入细胞后，miRNA能够通过两种方式与病毒发生相互作用，其一是调控miRNA 的表达控制病毒的增殖；另一种相互作用方式是宿主miRNA 与病毒的RNA 结合，以促进或抑制病毒在体内的复制、翻译等行为，从而改变病毒的致病机制，即通过阻碍病毒mRNA的翻译以抑制病毒的复制或通过提高病毒mRNA的稳定性，进而促进病毒的复制[18]。通过miRNA 能够靶向病毒的RNA，达到抑制病毒复制的特性，现已成为一种新的抗病毒的防御机制。miRNAs 是基因表达的重要转录后调节因子，对抗菌反应具有积极作用，同时，由病原体相关分子模式参与的宿主病原体识别受体也在激活针对微生物感染的先天免疫中发挥关键作用，微生物调节的miRNA和重要的PRRS信号通路之间的相互作用影响宿主对微生物病原体的免疫反应[19]。而miRNA的运输则是依靠外泌体完成。

外泌体是一种具有膜结构的囊泡，是常见的膜结合纳米囊，由细胞的胞吐作用形成并释放到细胞间隙中，囊内包裹各种核酸和蛋白质等成分，可被靶细胞摄取以达到传递信号的作用等，还能够作为生物标志物、疫苗和药物载体，并对其进行合理的修饰以进行治疗干预[20]。猪乳外泌体中含有非常多的与免疫相关的miRNAs，而且外泌体具有很强的抵抗力。有研究对饲喂初乳的幼猪进行体内血清检测，发现其miRNA 的表达量远远高于饲喂常乳的幼猪，表明这些miRNA可通过外泌体进入幼畜机体内；并且初乳中的miRNA 数量高于常乳，推测动物的母乳可影响幼崽的免疫系统发育，将miRNA传递给新生动物，并发挥其生物学作用。这些免疫相关的miRNA均会功能性地靶向编码细胞活素和其他免疫调节蛋白，以及免疫反应信号通路上的其他组分等特异性转录本，进而行使其免疫调控功能[21]。

2.2 外泌体中miRNA的作用以及对PRRSV的影响

已有许多研究以miRNA 为基础对病毒进行干扰、抵抗等，开展了达到防御病毒等目的的试验。郭雪坤[22]发现，有25 种可能抑制PRRSV 复制的候选miRNA，其中miR-181 的功能得到了具体验证。Zheng 等[23]研究发现，感染PRRSV 时，猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中miR-10a的表达水平升高，并通过下调宿主分子信号识别颗粒14（SRP14）蛋白的表达而进一步抑制病毒的复制，发现了一种新的抗PRRSV 感染的IRF8-miR-10a-SRP14 调控途径。Shi 等[24]发现，PRRSV-2 可能劫持宿主miR-541-3p以抑制宿主先天免疫应答，miR-541-3p 能够通过靶向干扰素调节因子7（IRF7）负调控Ⅰ型干扰素的转录，PRRSV-2 感染上调了miR-541-3p 的表达，从而促进miR-541-3p 在MARC-145 细胞中的复制，进而促进自身复制。还有研究发现，PRRSV 诱导的miR-218 下调有助于抑制Ⅰ型干扰素反应，并可能为治疗PRRSV 和其他病毒感染提供新的治疗靶点[25]。张小霞等[26]研究找到了猪感染PRRSV时潜在的候选lncRNA和靶基因。

有研究者对感染PRRSV猪的血清外泌体进行了鉴定和生物信息学分析，获得了多种PRRSV 相关途径和差异表达的miRNA，在PRRSV诱导的免疫应答、侵袭和外泌体摄取中起到潜在作用。此外，由于单个miRNA 可以靶向多个基因，并且单个基因也受到多个miRNA的调控，因此有许多miRNA在上述途径中执行多种功能。一些miRNA已被验证可以通过作用于关键受体或直接靶向病毒基因组调节PRRSV 感染[27]。miR-122 的过表达在转录后水平上负调控SOCS3蛋白的表达水平，导致IFN信号增强并减少病毒复制[28]。

研究表明，PRRSV感染通过延迟中和抗体的形成和细胞因子表达的失调影响先天性和适应性免疫应答。转录因子（TFs）的研究提高了对异常基因表达调控潜在机制的理解。在PRRSV 感染的情况下，TFs 介导PRRSV 的结构和非结构蛋白，用于调节炎症基因表达、免疫细胞、非编码RNA和其他相关宿主因子以及逃避宿主免疫反应，从而促进病毒复制。TF还有助于清除未被宿主免疫系统消除的病毒并抑制病毒入侵。靶向特定TFs的小分子药物的使用广泛用于各种人类疾病的治疗；因此，由于其在许多生物过程中的重要性及其在PRRSV感染期间的异常活性，TFs应被视为未来的治疗靶点[29]。

有研究发现，仔猪中断奶仔猪感染PRRS 的概率显著高于成猪和哺乳期仔猪，因此推测是母乳中的一些成分抑制了PRRSV 的繁殖，如母乳中外泌体中的miRNA 发挥了作用。此前，本课题组进行了提取猪乳中外泌体的试验，并将提取的外泌体对感染PRRSV的MARC-145细胞进行病毒滴度测定，结果表明，猪乳外泌体中miRNA 可抑制PRRSV复制[30]。

尽管在过去三十年中对PRRS的研究取得了巨大的进展，但对PRRSV 发病机制的分子和细胞机制的理解仍然有限，一些研究数据往往相互矛盾，难以解释。如最近有大量信息可用于miRNA，一些miRNA 促进PRRSV 复制，而另一些则抑制病毒复制，但其对PRRSV 的致病作用还需进一步研究。PRRS 研究还面临着一些挑战和困难，首先，猪缺乏合适的免疫生化试剂和工具，并且猪的许多蛋白质的细胞功能没有得到适当的表征。其次，PRRSV缺乏标准化的实验动物模型。第三，PRRSV的应变变化似乎对宿主反应影响很大。即使在相同的亚型中，不同的PRRSV菌株也可以表现出高序列变异，并显示出不同的表型。

疫苗研发方面也没有利用猪乳外泌体中的miRNA，相关研究人员尚未使用外泌体中miRNA制备PRRS疫苗，只是研发了一些传统疫苗但是效果微弱，利用miRNA 沉默技术作为弱化疫苗毒性的一种补充，是现阶段疫苗研发的方向和重点，由miRNA 介导的基因沉默可以弱化病毒活性，产生减毒活疫苗的重配株。大量试验证明，由miRNA介导的基因沉默新方法弱化的疫苗比传统方法生产的疫苗活性更弱，安全性更高。

3 展望

目前，对于miRNA 在抵御病毒方面的研究仍然是一项难题，miRNA 不好把握且数量较少，尤其是猪乳外泌体中存在的miRNA更甚，但该研究方向的前景很广，一旦突破将会为PRRS的治疗及预防起到帮助，也会为miRNA防御病毒提供参考。更好地了解PRRSV结合反向遗传学对宿主反应的调节可加快研发新一代以miRNA 为主导的PRRS 疫苗。这种分子方法将填补知识空白，并引导更加精细地了解PRRSV 的发病机制。随着科技进步，新型的PRRS疫苗必将在临床中得到广泛的应用。