聚乙二醇融合离断脊髓治疗完全性脊髓损伤的研究进展*1

王小刚 张卫华 申婷婷 王智慧 陈家扬 任晓平(通信作者)

( 广西中医药大学附属瑞康医院修复重建显微外科, 广西 南宁 530011 )

多方面原因造成的脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是当今临床上的灾难性疾病,是脊柱损伤最严重的并发症之一,目前全世界共有2 700 多万人因SCI 而长期残疾[1],在我国每年会新增6 万例SCI 患者,是世界上SCI 患者最多的国家,完全性SCI 会导致患者截瘫(四肢瘫痪或下肢瘫痪),截瘫患者终生被限制在床上或轮椅上,并且伴随着严重的甚至致命的并发症(如中枢神经疼痛、褥疮、下肢深静脉血栓、坠积性肺炎、尿路感染等)。 给家庭和社会带来沉重负担,因此,寻找有效的治疗药物和干预手段治疗SCI 是非常必要和紧迫的。 由于神经细胞再生困难,因此国内外在治疗SCI 方面尚无突破性进展,目前临床上针对SCI 治疗方式主要包括手术治疗和非手术治疗。 手术治疗的方法视临床情况而变,主要包括脊柱复位固定,椎管减压等。 此类脊柱重建手术主要针对椎体骨折脱位本身,对于损伤后的脊髓重建作用有限;非手术治疗主要包括对症药物治疗,包括皮质类固醇、促甲状腺素释放激素、阿片受体拮抗剂等,但这些药物多是缓解SCI 后引发的各种并发症,对于脊髓重建和功能恢复的作用甚微,无法从根本上改善受损神经的功能。 目前尚无有效且针对性强的治疗方法应用于临床。 脊柱遭受强大外力破坏引发的脊髓损伤使脊髓微环境遭到严重破坏,持续的出血、缺血、水肿和炎症反应导致大量神经细胞死亡[2]。 当脊髓的神经细胞以及胞外结构遭到破坏时,在原来的位置会产生微型囊腔,微型囊腔之间相互结合形成巨大的囊腔进一步限制轴突再生和细胞迁移。 损伤使星形胶质细胞激活并增生,形成胶质瘢痕来保护受损组织以防止其进一步受损,并阻止炎症的进一步扩散,但这种结构致密的瘢痕组织在损伤后期却成为难以跨越的物理学屏障,阻断了上行和下行的神经传导通路,阻碍脊髓轴突再生和功能恢复。 同时损伤后残留的脊髓断端向内、向外收缩形成狭长的空腔,这种环境使上下脊髓神经组织的链接无法形成[3-5]。

1 SCI 修复研究现状与关键技术

1.1 SCI 修复的相关研究

随着医学技术的发展和新药物的开发,人们对SCI 的认识愈发深刻,越来越多的医学工作者开始将目光转向对脊髓残端的修复,近年来出现了一些新的SCI 治疗方法,包括神经干细胞、生长因子、组织工程支架、外泌体等,这些方法对于SCI 治疗具有一定的作用,但治疗效果仍不尽人意,至今仍无可信服的病例以供参考,广大SCI 患者的治疗现状并未得到根本改变。 目前临床上关于SCI 的治疗仍以保守治疗为主。 任晓平团队为了攻克这个医学界难题做了大量的临床前实验研究,试图研发一种有效治疗SCI 的脊髓修复重建方法。

1.2 SCF 的关键技术

19 世纪初,斯图尔特和哈特教授报道了1 名26 岁女性患者,她的脊髓被0.32 mm 口径的枪支击断,离断脊髓之间的距离为0.75 英寸,由5 位主治医师共同证实:“脊髓残端用3 根肠线缝合,通过1 根细小弯针前后穿过残留脊髓断端固定连接。 这部分手术非常困难,因为脊髓残端之间的间距很宽,在末端最终合拢之前,肠线经常撕裂。”16 个月后,“病人靠自己的力量从床上滑到椅子上,并能1 只手扶住椅背实现站立姿态,支撑身体的大部分重量[6]。”19 世纪60 年代,神经外科医生弗里曼对脊髓完全横断的狗模型活动情况进行观察。 他切除了狗身上受损的脊髓组织形成间隙,通过剔除受损区域锥体[7]来短缩脊髓间隙,使2 个完整的脊髓断面紧密接触并缝合硬脊膜,几个月后他观察到动物恢复了行走功能[8-10],然后他又在小鼠和大鼠上进行相同实验取得了类似结果[11],这些动物不仅恢复了下肢运动功能,并且组织学检查中脊髓横断区发现大量的新生轴突穿过了横断区域到达远端,许多断裂后的轴突断端也重新连接,并在电生理检查发现存在明显的电信号传导迹象。 这些成功案例为临床如何针对SCI 治疗治疗提供了新的思路,即通过移除受损的、有疤痕的脊髓节段,并将2 个未受损的、严重横断的脊髓残端连接在一起,重建完整的中枢神经系统。任晓平和意大利医学家卡纳维罗教授从中受到启发[12],合作开发了脊髓融合术(SCF),旨在解决脊髓损伤后的脊髓重建和功能修复这一医学难题,旨在解决脊髓损伤后的脊髓重建和功能修复这一医学难题。 聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是无毒性、无刺激性的一类水溶性线性聚合物,由环氧乙烷的活性阴离子开环聚合而成,分子量在0.4 ～100 kDa之间。 PEG 能形成相对的疏水结构域分布在脊髓断端附近作为保护屏障,迅速包裹破损的细胞起到维持细胞结构的支架功能,防止细胞质的流失,保护线粒体功能,介导破损的细胞膜再封闭并为膜修复过程争取时间和提供物质基础。 PEG 最早的用途是用于植物原生质体融合,后续又被用于细胞融合领域。 英国Bittner 团队通过切断成年小龙虾中枢神经系统轴突(MGA),将其浸泡在PEG 为主要成分的聚合液中来观察轴突变化,发现PEG 能通过修复膜损伤,诱导切断的小龙虾MGA 产生轴浆连续性,这一发现表明了切断后的轴突在PEG 作用下实现了上、下端脊髓的传导连续性。 同时PEG 的修复膜损伤功能还通过封闭轴突断端膜防止轴突进一步损伤,并提供了断端对接轴突的恢复环境[13-15]。 研究表明,在横断的脊髓处立即应用PEG,脊髓断面会在约1 周后开始大面积出现肥厚的瘢痕[16],但在此之前从脊髓两端再生的轴突将会很好地透过瘢痕连接脊髓灰质。 有令人信服的支持证据表明,星形细胞瘢痕实际上在脊髓损伤早期有促进轴突再生的作用[17-18],如保护损伤区微环境、缓解局部炎症等。由于PEG 并不能阻止瘢痕的形成,所以也不会剥夺再生过程早期疤痕(1 周内)的有效增益作用[19-20]。基于PEG 的化学特点我们选择将其作为脊髓融合剂并用于临床试验,突破了既往SCI 治疗方式的局限,从组织形态学上重建了脊髓连续性。 在SCF 术后加入脊髓电刺激具有加速受损神经再生、促进固有神经元兴奋、调制神经电信号等多种作用,因此,采用电刺激来加速脊髓神经融合和运动感觉恢复是非常重要的。 既往临床研究也表明,电刺激可增强周围神经再生,有效改善周围神经损伤的感觉功能修复过程。 因此,在SCF 的术后康复中会视情况采用电刺激设备,以加速桥接脊髓的修复进度,同时再加入人工或机械制动等方式来促进恢复,SCF 的术后康复是一个长期且艰难的过程,优质的术后康复锻炼带来的疗效十分显著,因此对康复计划的完善十分有必要。

2 关于SCI 修复研究的动物实验与临床研究

2.1 动物实验研究数据

多年来任晓平团队先后在小鼠、大鼠、比格犬、猴子的脊髓完全横断模型上进行SCF 实验。 首先去除动物T10椎板,切开硬脊膜暴露脊髓,使用根据动物脊髓直径定制的脊髓弯钩在硬脊膜内完全勾住脊髓,然后使用“锋利的人造宝石刀”快速地离断脊髓,最后脊髓弯钩无阻碍垂直提起证明脊髓已完全离断。 该脊髓损伤模型可以保证实验动物是完全性脊髓损伤,因此术中脊髓断端应用PEG,术后动物下肢运动功能的恢复可以明确地证明PEG 融合离断脊髓神经纤维的能力。 此外,在硬脊膜内使用“锋利的人造宝石刀”快速地离断脊髓可以保证脊髓断端对合良好,这一点是PEG 发挥脊髓融合作用的重要前提。实验首先在啮齿类动物上展开,大鼠小鼠在术后的数周观察中成功恢复了大部分运动功能。 术后对大小鼠的电生理检测中发现脊髓横断区通过了动作电位,大鼠的弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)检查也显示脊髓轴突断端的白质纤维束恢复了组织连续性[21-22]。 其后我们在狗的脊髓完全横断模型中取出一截脊髓尾端的半切脊髓移植到脊髓横断面并使用了以PEG 为主要成分的脊髓融合剂[23],术后第6 个月实验组中的所有大狗都恢复了自主行走的能力(未使用PEG 的动物对照组没有)。 术后180 天对动物的MRI 检查里也显示实验组的大狗横断区脊髓神经纤维再生明显更好,并在扩散张量成像(DTI)的图像中显示了术后损伤区脊髓神经组织恢复了部分的连续性。 观察结束后,各组动物均被处死并送检,我们在组织学检查发现了实验组大狗受创脊髓组织再生的重要证据,在对照组中我们没有这一发现。 后来在猴的SCF 实验中我们得到了几乎相同的结果[24]。

2.2 临床转化应用

前期动物实验说明PEG 对脊髓神经修复有着积极有效的作用,但目前所有实验动物都是通过手术形成的超急性期脊髓横断模型,临床上很难找到这样即时损伤的案例,常见的脊髓损伤类型是一个长距离、长时间损伤,这对术后的功能恢复有很大影响,那么脊髓完全横断模型上的PEG 介导的脊髓融合术是否有临床意义呢? 我们在临床截瘫患者的脊髓损伤区通过手术修剪出2 个平整的脊髓断面并且通过去除损伤区的椎体和受损的脊髓,短缩脊椎使2 个脊髓断面对接良好,因此PEG 介导的脊髓融合术可以治疗SCI 的实验成果是非常有意义和价值的。 我们前期临床试验收住的所有SCI 患者都是陈旧性脊髓损伤,患者受伤时间多数超过1—5 年,脊髓损伤区大段空缺,游离离断脊髓组织横断面两端缺损长度平均为6 cm,脊髓横断面被致密瘢痕结缔组织包裹,这些部位的手术设计是最为困难的,手术过程复杂并且临床SCI 患者的病情因人而异。 日本的吉田教授[25]等人从实验中发现横切面的平整度是影响轴突再生成功的最重要因素之一,在对合平整的情况下,脊髓水肿的情况会很好的改善,并且相对平整的脊髓组织对合后也会减少间隙的产生,对抑制胶质瘢痕的生长很有帮助。 我们在不损伤健康脊髓组织的前提下快速切除脊髓横断面致密瘢痕组织来暴露脊髓轴突,尽可能保持切面平整。 因此我们选择使用锋利的手术器械边缘横断脊髓创面瘢痕,然后采取常用的2 种方法桥接脊髓断端,一种是在患者损伤部位切取一半带有一侧脊髓背动脉的带血管蒂的半切脊髓,移植到脊髓断面之间桥接脊髓的远近端,保留一侧脊髓背动脉血管蒂,以保证被移植到断面之间的脊髓拥有充足的血液供应,移植后产生了2 个脊髓断面,断面局部应用PEG 为主要成分的脊髓融合剂完成脊髓融合[26]。 另一种是取患者小腿处的腓肠神经进行移植[27],取出腓肠神经后,将腓肠神经平均切割成数根,并将所有腓肠神经按照神经的远近端方向并排缝合为一股腓肠神经,将腓肠神经移植到脊髓断面之间桥接部位的远近端,最后在2 个脊髓断面局部应用脊髓融合剂完成手术。 需要注意的是由于横切后的脊髓轴突的末端仅稳定在10—20 分钟左右,否则轴突组织就会发生严重水肿变性(沃勒变性前第1 步)[28],因此对移植脊髓组织的操作时间要严格控制( ＜10 分钟)。 目前临床试验的所有SCI 患者全部是采用上述方式完成手术,暂未用于临床的还有脊椎短缩术和异体脊髓移植术。 前者适用于急性锐器伤的SCI 患者,切除损伤节段的椎体,在两端对合平整的脊髓断面处应用融合剂进行脊髓融合。 后者是从异体脊髓供体上切取等长并位置对应处的脊髓,移植到SCI 患者的脊髓损伤区域,然后局部应用融合剂完成脊髓融合[29]。 我们对共计 20 名 SCI 患者进行了SCF[26-27],术前影像学DTI 和电生理检查下综合评估所有受试者均为胸腰段脊髓完全性损伤,在无任何手术禁忌证前提下开展手术,所有受试者都顺利完成手术,并接受了在我院的康复治疗,我们在受试患者术后康复中加入了经颅磁电刺激(TMS)和机器人辅助锻炼行走等项目等来提高康复质量,电刺激具有加速神经再生、促进脊髓固有神经元兴奋、调制损伤电流等多种作用,机器人辅助行走过程中帮助大脑重建电生理信号认知通路,这些器械对促进SCI患者的术后康复大有助益。 术后展开对患者不同时间段的病情观察,从行为学、影像学检查、电生理检查中综合评估患者病情变化。 术后患者住院期间的影像学DTI 显示桥接神经组织间形成连续性,电生理检查显示大脑部位传出的电信号通过了脊髓修复区,在之后的随访电话和视频中我们也看到有部分患者术后损伤平面以下肢体运动和感觉好转,能自行控制下肢部分活动,并且超过半数的患者神经损伤平面以下的出汗及大小便等自主神经功能改善。但仍有多数患者运动功能还没有得到改善,出现好转的患者中也没有出现可脱离支具活动者(目前恢复较好的患者可手扶双杠进行行走,时长可达1 小时),个体之间疗效差异性很大,目前考虑问题存在的可能原因是观察期尚短,同时患者损伤平面下肢体对大脑信号的识别(脑再认知功能)是一个漫长的过程,因此我们会在所有SCF 患者术后进行定期随访,通过长期的康复治疗来实现对肢体感觉活动的再学习,以期达到理想疗效[26-27,30]。 PEG 的功效主要是封闭轴突断端膜、促进轴突再生,并不能抑制胶质瘢痕,因此,因此术后患者脊髓移植区瘢痕再生不可避免,脊髓损伤后星形胶质细胞的过度增生使损伤部位纤维化,而我国中药在抗纤维化方面具备一定优势,因此下一步我们计划通过活血化瘀类的中药方剂软化胶质瘢痕,减缓脊髓纤维化,从而优化脊髓融合术的效果。 还有一个发现是术后一部分SCI患者中枢神经痛得到了显著缓解,这是一种可能由CNS 异常放电引发的患肢疼痛,是脊髓损伤最严重的并发症之一,会在约40%以上的SCI 患者身上发生[31-32],在我院收住的20 位SCI 患者中有15 位术前有脊髓中枢神经痛症状,有14 位患者在术后数个月里疼痛得到了不同程度的缓解,但也有2 位术前没有脊髓中枢疼痛症状的患者在术后出现了脊髓中枢疼痛症状,这可能是在手术过程中对患者正常脊髓组织的破坏所造成。

3 研究成果总结

目前临床试验研究证明了SCF 可以重建陈旧性SCI 组织的连续性和脊髓神经纤维电的传导功能.同时也证明了SCF 临床手术的安全性和可操作性,其次发现在SCI 部位切除瘢痕组织可能有助于缓解一些患者的脊髓中枢神经痛。 在临床研究和检查中,患者自体移植的腓肠神经束和半切脊髓的神经轴突可以与近远端脊髓残端的轴突在组织学上实现连接与融合,为脊髓电信号的传导和功能恢复提供了必要的组织学基础,并且有部分患者术后恢复了部分感觉和运动功能。 存在的问题是仍然有大部分的患者神经平面下的感觉与运动功能没有得到恢复(术后半年随访结果)[26-27,30]。 因此在接下来的临床试验中,我们将继续优化SCF 方案,最大限度地减少脊髓桥接部位瘢痕的形成,同时进一步完善术后康复治疗,采用AI、VR 等前沿技术医工结合的加强患者康复锻炼,并可以借助我国优质中草药方剂来加快恢复进程,希望借助这些方式能促进SCF 对治疗SCI的效果。 我们可以从文中发现动物实验的数据表现要优于我们的临床试验,考虑到实验动物都是手术快速形成的脊髓横断模型,创伤期短并且创伤后即刻对离断脊髓进行融合连接,而临床实验中我们选择的患者都为陈旧性SCI,还尚未开展SCI 急性期患者,因此,我们是否能设想对SCI 急性期患者采用SCF,疗效会优于临床的陈旧期患者? 这给我们带来了新的思考。 但介于临床试验开展时日尚短,目前关于PEG 治疗完全性脊髓损伤相关临床成果及其长期观察治疗效果的评估还需要长期随访研究来进一步验证。 我们团队首次在脊髓横断模型上验证了PEG 的效果,通过PEG 的膜修复功能展示了PEG 有能力融合离断的脊髓并恢复部分感觉运动功能,并且随着临床转化工作的不断进展,我们还将不断探索如何优化SCF 手术方案及重塑大脑对肢体运动、感觉的认知。 美国加州大学神经外科教授、国际神经外科杂志主编Ausman 教授查阅了大量关于脊髓融合治疗的相关研究文献,并不断关注我们在SCF方面的相关研究进展,他这样评价了我们的工作,“SCF 相关研究工作是医学上的一个飞跃,这些突破性发现是医学史上的里程碑”[33],高度肯定了SCF相关研究工作的重要性以及前瞻性。 另一位美国梅奥医院外科教授、美国外科杂志主编Sarr 教授同样对我们的工作表达了支持,他评价道:“该项研究成果将可能为脊髓损伤病人带来一次革命性的改变,鼓励医学界秉持开放的态度和思想去考虑SCF 治疗截瘫新理念”,相信SCF 有望改变广大SCI 患者的治疗现状。