基于近红外光谱和中红外光谱技术的金振口服液中间体含量预测模型研究

李秀梅，徐芳芳，张 欣，刘佳丽，张永超，樊 成，王振中

1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023

2. 中药制药过程控制与智能制造技术全国重点实验室，江苏 连云港 222001

3. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001

4. 中药提取精制新技术重点研究室，江苏 连云港 222047

金振口服液（Jinzhen Oral Liquid，JOL）组方为山羊角、平贝母、大黄、黄芩、青礞石、石膏、人工牛黄、甘草，具有清热解毒、祛痰止咳的功效，临床用于治疗小儿支气管炎、支气管肺炎、上呼吸道感染等症[1-3]。矿、植物药浸膏中主要功效成分为黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸[4-6]。人工牛黄浸膏中主要功效成分为胆酸和猪去氧胆酸[7]。除上述功效成分外，固含量也是中药浸膏质量控制的关键指标[8]。目前，仅对该产品中的黄芩苷含量进行质量控制，缺少过程控制标准，矿、植物药浸膏和人工牛黄浸膏为JOL 生产过程的关键中间体，其质量好坏直接影响产品质量。

近红外光谱（near-infrared spectroscopy，NIRS）技术和中红外光谱（mid-infrared spectroscopy，MIRS）技术是一类分析速度快、不损害样本、操作简单的现代仪器分析技术。通过NIRS、MIRS 技术建立定量预测模型对指标进行快速检测，已在中药质量控制方面有了大量应用[8-13]。本研究将NIRS 和MIRS 技术结合化学计量学方法，应用于JOL 浸膏，建立8 个指标的偏最小二乘（partial least squares，PLS）定量模型，实现对黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸、猪去氧胆酸、胆酸含量、和矿、植物药及人工牛黄固含量的快速测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器

React IR702L 型原位傅里叶变换中红外光谱仪，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；Antaris II 型傅里叶近红外变换光谱仪、Vanquish Core 型高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ALL Chrom ELSD 6100 型蒸发光散射检测器，广州万谱仪器有限公司；Mettler Toledo 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；H1650-W 型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-500DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 材料

96 批次的矿、植物药浸膏，批号为Z230101～Z230196；95 批次的人工牛黄浸膏，批号为Z230101～Z230195，均由江苏康缘药业股份有限公司提供。对照品黄芩苷（批号110715-202223，质量分数97.2%）、汉黄芪苷（批号112002-201702，质量分数98.5%）、甘草酸铵（批号110731-202111，质量分数94.4%）、没食子酸（批号110831-201906，质量分数91.5%）、猪去氧胆酸（批号 100087-201411，质量分数99.7%）、胆酸（批号100078-201415，质量分数98.9%）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇，色谱纯，美国Tedia 公司；甲醇，分析纯，南京化学试剂有限公司；甲酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 NIRS 的采集

在室温条件下，空气作为背景，使用液体透射法（1 mm 比色皿），光谱扫描范围4000～10 000 cm−1，扫描次数为32 次，分辨率8 cm−1，衰减器选择C 模块，1 倍增益，每个样品采集3 次，取平均光谱，采集NIRS 结果见图1。

图1 矿、植物药浸膏 (A) 和人工牛黄浸膏 (B) 的NIRS原始光谱Fig. 1 NIRS original spectra of mineral plant extract (A)and artificial bezoar extract (B)

2.2 MIRS 的采集

在室温条件下，以空气为扫描背景，使用ATR光纤探头扫描样品，光谱扫描范围650～3000 cm−1；扫描次数32 次；分辨率8 cm−1；增益选择“low”，扫描速度为7 次/s。采集MIRS 结果见图2。

图2 矿、植物药浸膏 (A) 和人工牛黄浸膏 (B) 的MIRS原始光谱Fig. 2 MIRS original spectra of mineral plant extract (A)and artificial bezoar extract (B)

2.3 有效成分的含量测定

2.3.1 色谱条件

（1）矿、植物药浸膏：色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，8%～25%甲醇；5～7 min，25%～30%甲醇；7～10 min，30%～40%甲醇；10～31 min，40%～60%甲醇；31～40 min，60%～70%甲醇；40～54 min，70%～100%甲醇；54～60 min，100%～8%甲醇；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长为270、254 nm（甘草酸）；进样体积5 μL。

（2）人工牛黄浸膏：色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液，比例为75∶25；柱温30 ℃；ELSD 气体体积流量2.0 L/min；漂移管温度80 ℃，雾化器温度80 ℃，光池温度72 ℃，光肼温度72 ℃；增益值1.0；进样体积2 μL。

2.3.2 混合对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵（甘草酸＝甘草酸铵/1.020 7）、没食子酸对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成含黄芩苷500.39 μg/mL、汉黄芩苷109.14 μg/mL、甘草酸145.02 μg/mL、没食子酸64.05 μg/mL 的矿、植物药对照品溶液。

精密称取猪去氧胆酸、胆酸对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成含猪去氧胆酸746.55 μg/mL、胆酸589.13 μg/mL 的人工牛黄对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 分别精密吸取2 种样品各1 mL 置于50、20 mL 量瓶中，用纯化水溶解、稀释并定容至刻度，摇匀，12 000 r/min 条件下离心（离心半径6 cm）5 min，取上清液，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3.4 线性关系考察 分别精密称取黄芩苷11 mg、汉黄芩苷3 mg、甘草酸铵3 mg、没食子酸3 mg、置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 置10 mL 量瓶中，定容，摇匀，即得系列对照品溶液。

分别吸取上述系列对照品溶液5 μL，注入HPLC-UVD，进行测定，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得线性回归方程：黄芩苷Y＝289.32X－1.629 2，R2＝0.999 9，线性范围43.5～435.0 μg/mL；汉黄芩苷Y＝363.06X－1.039 1，R2＝0.999 9，线性范围13.71～137.10 μg/mL；甘草酸Y＝72.989X－0.100 8，R2＝0.999 9，线性范围12.12～121.20 μg/mL；没食子酸Y＝285.67X－0.147 5，R2＝0.999 9，线性范围10.65～106.50 μg/mL。

取人工牛黄对照品溶液（猪去氧胆酸746.5 μg/mL，胆酸589.1 μg/mL），分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.5 μL 注入HPLC-ELSD 进行测定，以对照品质量浓度对数值为横坐标（X），峰面积对数值为纵坐标（Y），得线性回归方程：猪去氧胆酸Y＝1.756 2X＋1.719，R2＝0.999 5，线性范围0.373 3～2.053 0 mg/mL；胆酸Y＝1.752 4X＋1.705 8，R2＝0.999 9，线性范围0.294 6～1.620 1 mg/mL。

2.3.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，按“2.3.1”色谱条件连续进样6 次，结果黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸、猪去氧胆酸、胆酸峰面积的RSD 分别为0.46%、0.45%、0.48%、0.45%、0.58%、0.58%，在此条件下精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 按“2.3.2”项下方法制备对照品溶液，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别在不同时间点（0、2、4、6、8、10、12、16、24 h）进样，结果对照品溶液中黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸、猪去氧胆酸、胆酸峰面积的RSD 分别为0.50%、0.83%、0.46%、0.59%、0.80%、0.95%，供试品峰面积的RSD分别为0.60%、0.83%、0.28%、1.32%、0.93%、0.97%，结果说明对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 按“2.3.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，计算样品中各成分的含量，结果黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸、猪去氧胆酸、胆酸质量分数的RSD 分别为1.52%、1.40%、1.35%、1.49%、1.88%、1.85%，表明该方法重复性好。

2.3.8 加样回收率试验 按“2.3.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别精密加入0.5 mL 矿、植物药混合对照品溶液（同“2.3.2”项）和人工牛黄混合对照品溶液（同“2.3.2”项），按“2.3.1”项下色谱条件进样，计算加样回收率，得到黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸、猪去氧胆酸、胆酸的平均加样回收率依次为104.8%、102.9%、104.5%、107.4%、110.7%、108.3%，RSD 分别为0.30%、0.98%、0.79%、1.86%、0.61%、0.55%，符合定量分析要求。

2.3.9 指标测定结果 在“2.3.1（1）”色谱条件下，待仪器稳定基线平稳后，分别精密吸取矿、植物药混合对照品溶液与供试品溶液各5 µL，注入HPLCUVD 测定。用外标法计算样品中黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸的含量。在“2.3.1（2）”项色谱条件下，待仪器稳定基线平稳后，分别精密吸取人工牛黄混合对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.5µL 与供试品溶液2 µL，注入HPLC-ELSD 测定。用外标五点法对数方程计算样品中猪去氧胆酸、胆酸的含量。6 个指标成分的含量测定结果见表1、2，均用于后续建立含量预测模型。

表1 矿、植物药浸膏指标测定结果Table 1 Indicator measurement results of mineral plant extract

表2 人工牛黄浸膏指标测定结果Table 2 Indicator measurement results of artificial bezoar extract

2.4 固含量的测定

精密称取5 g 浸膏液，置已干燥至恒定质量（X0）的蒸发皿中，称定质量（X1），置水浴上蒸干后，在105 ℃条件下烘至恒定质量，移置干燥器中，冷却30 min，迅速称定质量（X2），计算固含量。结果见表1、2。

2.5 定量模型的建立

2.5.1 校正集与验证集的划分 采用Kennard-Stone（K-S）划分法[14]，按照4∶1 划分为校正集和验证集，以确保所选验证样品集更具代表性，划分结果为矿、植物药浸膏，校正集样本77 个和验证集样本19 个；人工牛黄浸膏，校正集样本77 个和验证集样本18 个。

2.5.2 光谱预处理 光谱的采集会受到外界环境的影响，预处理可消除其他因素对数据信息的影响，提高模型的稳健性[15]，本研究采用移动平均法（moving average，MA）、Savitzky-Golay（SG）平滑法、一阶导数SG 平滑法（SG 1st）、基线校正、归一化法以及标准正态变量变换（standard normal variate，SNV）分别对NIRS 和MIRS 光谱进行预处理，建立2 种浸膏的8 个指标的PLS 定量模型。以校正集相关系数（Rcal）、预测集相关系数（Rpre）、校正集均方根误差（root mean square errors of calibration，RMSEC）、交叉验证均方根误差（root mean square errors of cross validation，RMSECV）、预测均方根误差（root mean square errors of prediction，RMSEP）、性能偏差比（ratio of performance to deviation，RPD）和预测相对偏差（relative standard error of prediction，RSEP）作为模型评价指标。其中Rcal与Rpre越大模型拟合效果越好，RMSEC、RMSECV、RMSEP、RSEP 越小，RPD 越大，模型的预测性能越好[16]，根据上述评价指标筛选出最佳光谱预处理方法。

NIRS 和MIRS 预处理结果见表3、4，可以发现：NIRS 中，黄芩苷和没食子酸的最佳预处理方法是SG 平滑，汉黄芩苷、甘草酸和猪去氧胆酸的最佳预处理方法是基线校正，胆酸和矿、植物药固含量的最佳预处理方法是SG 1st，人工牛黄固含量的最佳预处理方法是SNV；MIRS 中，没食子酸、胆酸和矿、植物药固含量的最佳预处理方法是SG 平滑，甘草酸、猪去氧胆酸和人工牛黄固含量的最佳预处理方法是MA，黄芩苷和汉黄芩苷的最佳预处理方法分别是归一化法和基线校正。

表4 不同的预处理方法对MIRS 模型的影响Table 4 Effects of different preprocessing methods on MIRS models

2.5.3 光谱波段的筛选 筛选光谱波段可以剔除无用信息，提高模型的预测精度和稳定性[9]。本研究在上述筛选出的最佳预处理方法的基础上，对比全光谱、间隔PLS（interval PLS，iPLS）、组合间隔PLS（synergy interval PLS，siPLS）及移动窗口PLS（moving windows PLS，mwPLS）的建模效果。

上述3 种波段筛选方法建立的模型与全光谱模型的性能参数对比结果见表5、6，综合考虑各项指标选择最佳光谱波段。结果表明，基于NIRS 技术，汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸、胆酸选择全光谱区间（3 999.64～9 999.10 cm−1）建模，模型性能更好；黄芩苷、猪去氧胆酸和人工牛黄固含量模型经mwPLS 法筛选波段后的结果优于其他方法，分别选择4 801.882～4 979.301、5 769.973～6 753.49 cm−1；4 015.068～6 394.796、6 545.216～8 874.804 cm−1；4 223.342～4 693.888、5 418.991～5 955.105 cm−1作为建模波段；矿、植物药固含量模型选择siPLS 法效果最好，建模波段是3 999.64～4 296.624、6 707.207～7 004.191、8 211.411～8 508.396 cm−1。

表6 不同建模波段对MIRS 模型的影响Table 6 Effects of different waveband modeling on MIRS models

基于MIRS 技术，甘草酸和没食子酸经siPLS法筛选波段后，模型预测性能提高，故分别选择1460～1348、1344～1232、1228～1116 cm−1；1576～1464、1460～1348、996～884 cm−1作为建模波段；黄芩苷、汉黄芩苷、猪去氧胆酸、胆酸和矿、植物药固含量及人工牛黄固含量的预测模型经mwPLS法筛选波段后的结果优于其他方法，故分别选择1544～1200、1096～1084、968～944 cm−1；1736～652 cm−1；1708～1496、1240～1148 cm−1；1692～1116 cm−1；1776～1660、1628～1620、1532～676 cm−1；1552～1112 cm−1作为建模波段。

2.5.4 光谱数据融合 多光谱数据融合技术，将不同类型的光谱进行优化和整合，实现光谱优势互补，以获得更全面可靠的特征数据，再结合化学计量学方法构建回归模型，对样品进行定量和定性分析[17]。本研究采用光谱特征层融合技术，将原始数据进行预处理、筛选波段后再融合，实现对单一光谱信息的补充，部分指标融合后建立的模型有更好的效果。基于上述最佳建模条件，将近红外和中红外光谱数据进行整合，采用PLS 法建立指标的定量模型，并与NIRS、MIRS 单一光谱建模效果进行比较，结果见表7。由表7 可知，没食子酸、胆酸和矿、植物药固含量的融合模型预测效果强于NIRS 和MIRS模型，黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、猪去氧胆酸、牛黄固含量的NIRS 模型的预测效果最好。

表7 预测模型参数比较Table 7 Comparison of prediction model parameters

2.5.5 模型建立 模型经过光谱预处理方法的选择、最优建模波段的确定及光谱数据的融合后，运用PLS 法分别建立了8 个指标的定量模型，依据RPD 值和RSEP 值选择最佳模型。黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、猪去氧胆酸含量、牛黄固含量NIRS 模型的预测效果最佳，RPD 值分别为3.592、3.457、3.503、3.604、12.771，RSEP 值分别为5.88%、6.20%、7.97%、5.69%、0.96%，故选择5 个指标的NIRS 预测模型作为最优模型；没食子酸、胆酸和矿、植物药固含量的融合光谱数据模型预测效果最好，RPD值分别为2.554、7.106、4.797，RSEP 值分别5.65%、3.82%、1.30%，故选择3 个指标的融合模型作为最优模型，结果见表8。8 个指标的最佳模型的预测值与实测值的相关性如图3 所示。

图3 8 个指标的实测值与预测值的相关性Fig. 3 Correlation between measured value and predicted value of eight indicators

表8 指标的最优模型参数Table 8 Optimal model performance parameters of indexes

2.5.6 模型验证 将验证集的光谱数据导入已建立的最佳模型中，根据样品的实测值和模型预测值，计算其相对误差。黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸、猪去氧胆酸、胆酸含量和矿、植物药、人工牛黄固含量的模型预测值与样本实测值的平均绝对偏差（mean absolute deviation，MAD）及平均相对偏差（mean relative deviation，MRD）见表9，结果显示这8 个指标的MRD 均小于6%。

表9 验证集样本预测值与实测值的对比Table 9 Comparison between predicted and measured values of validation set samples

3 讨论

本研究以JOL 浸膏中黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸、猪去氧胆酸、胆酸的含量和矿、植物药、人工牛黄固含量为指标，采用NIRS、MIRS技术，经过光谱预处理、波段筛选，将近、中红外数据特征层融合，结合PLS 法，建立了8 个指标的含量预测模型。模型的RMSEC 和RMSECV 均小于2.5%，RMSEP 小于2%，RSD 大于2.5，RSEP小于8%，可用于金振口服液JOL 浸膏指标的快速检测。

对比NIRS 和MIRS 模型预测效果发现，NIRS模型均优于MIRS 模型，这可能与指标的质量浓度有关[18]。黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸、没食子酸、猪去氧胆酸、胆酸的平均质量浓度分别为18.32、3.77、3.99、1.63、16.53、13.21 mg/mL，均高于1 mg/mL，均为高质量浓度分析物，矿、植物药固含量为32.53%，人工牛黄固含量为13.69%，亦属于高质量分数，8个指标的NIRS 模型均优于MIRS 模型。其中汉黄芩苷、甘草酸和没食子酸的质量浓度低于其他指标成分，发现它们的预测模型效果稍差。即对于高质量浓度的分析物，NIRS 表现出比MIRS 更好的预测性能。

对比融合光谱数据模型和NIRS、MIRS 模型发现，没食子酸、胆酸含量和矿、植物药固含量的模型在光谱数据融合后效果更好，其他指标在融合后效果不如NIRS 单独建模，两者融合仅起到折中的效果。融合模型可提取2 种光谱中有效信息，提高模型效果，但不具有广泛适用性，融合效果不佳的指标可尝试不同的预处理方法，选择不同类型的光谱组合进行建模。本研究表明，NIRS 和MIRS 作为一种快速检测技术，均可应用于生产过程质量控制，具有快速、无损、操作简单等优点。光谱融合技术可实现单光谱优势互补，但并不一定适用于所有情况，有待于进一步深入研究，本实验建立的金振口服液JOL 浸膏定量模型可以实现快速检测，为生产质量控制提供依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突