中性粒细胞的异质性与肿瘤

叶依依

作者单位：200032 上海 上海中医药附属龙华医院中医外科研究所

近年来，随着免疫疗法在癌症治疗应用中突飞猛进，T 细胞、NK 细胞、巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞在癌症生物学中发挥重要作用［1］。中性粒细胞有别于其他免疫细胞，具有非增殖、生存期短等特性。人体发生感染时，中性粒细胞作为天然免疫系统的一线防御，会迅速聚集到感染部位和炎症组织，执行特定的免疫功能。目前对中性粒细胞的研究多限于感染性疾病，但近期有研究发现，在癌症背景下，中性粒细胞的生物学行为会发生很大的改变并影响肿瘤进展。本文就中性粒细胞在肿瘤生长和转移中的生物学作用及临床应用和靶向中性粒细胞治疗癌症的可能性作一综述。

1 中性粒细胞的异质性和功能

在正常生理状态下，中性粒细胞产量高、寿命短，在机体内保持动态平衡。健康人体循环中的中性粒细胞半衰期为5～10 h，此后快速进入自发凋亡［2］。在癌症背景下，中性粒细胞在骨髓中大量扩增并释放，其中还包括许多未成熟的中性粒细胞。一旦从骨髓中释放，中性粒细胞会被CXC 趋化因子受体CXCR2的配体CXCL1、CXCL2、CXCL5 和CXCL8 募集到肿瘤［3］。有证据表明，肿瘤相关细胞因子有助于中性粒细胞存活，癌症患者中性粒细胞的半衰期延长到17～84 h［4］。ZHU 等［5］分析了黑色素瘤患者的血液样本，从中鉴别出7 种不同的中性粒细胞亚群，而且这些细胞亚型在体外表现出不同的吞噬能力和活性氧产生能力，在癌症发生和进展中也承担不同功能。

中性粒细胞的异质性和功能改变受到多种因素的影响，这些因素包括癌症、感染、肥胖、压力及其他慢性炎症性疾病［6］。癌症类型与宿主状态是影响中性粒细胞异质性的决定性条件，但是目前中性粒细胞与肿瘤进展的确切关系仍存在较大争议。既往研究提出中性粒细胞具有与巨噬细胞类似的极化表型，表现出促肿瘤和抗肿瘤两种相互矛盾的作用［7］。参照M1/M2肿瘤相关巨噬细胞命名方案，肿瘤相关中性粒细胞的极化表型分为N1 型和N2 型。其中，N1 型（抗肿瘤表型）中性粒细胞的细胞核呈过多分叶状，具有肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、细胞间黏附分子1、Fas 等因子高表达的特征，它能活化簇分化抗原8（cluster of differentiation 8，CD8）T 细胞，具有很强的体外杀伤肿瘤细胞能力［7］；N2 型（促肿瘤表型）中性粒细胞的细胞核形态多为环状，它能产生并释放大量精氨酸酶（arginase，Arg），且高表达CCL趋化因子2［chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2］、CCL5 等因子，耗竭此类细胞能活化瘤内T 细胞，抑制肿瘤生长［7］。虽然N1/N2 型中性粒细胞的概念已经深入人心，但是仍缺乏足够的证据证明其存在，目前尚无特定的表面标志物可以明确区分。

此外，还有其他描述中性粒细胞不同极化状态的术语，如多形核粒细胞（polymorphonuclear granulocyte，PMNs）和多形核髓源性抑制细胞（polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells，PMN-MDSCs），以及低密度中性粒细胞（low-density neutrophils，LDNs）和高密度中性粒细胞（high-density neutrophils，HDNs）。在肿瘤生长过程中，PMNs可转变成病理激活的PMNMDSCs。目前研究认为PMN-MDSCs 的标志物为CD11b+Ly6G+Ly6Clow，主要特征是S100 钙结合蛋白A8/A9 复合物（S100A8/A9）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）高表达［8］。此外，其氧化磷酸化和糖酵解的速率也大幅升高，三磷酸腺苷生成增加，显示出超强的自发迁移特性［9］。LDNs 和HDNs 根据中性粒细胞的浮力密度不同划分。循环中的中性粒细胞具有钟型分布的密度异质性，且这种异质性同时存在于健康和疾病机体中。在正常小鼠体内，超过95%的循环中性粒细胞是HDNs［10］。但在炎症或肿瘤状态下，LDNs 占比升高，且随着肿瘤进展进一步增加；HDNs 则表现出较高水平的吞噬作用，并介导肿瘤细胞毒性，体内过继转移HDNs 能显著延缓早期肿瘤生长［10］。与HDNs 相比，LDNs 产生的活性氧较少，其对内源性趋化肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸的反馈更活跃，抗菌能力更强，且能抑制T 细胞增殖［11］。虽然中性粒细胞的极化确切存在，但是这些术语还过于简单和片面，仍无法通过这些术语准确地区分中性粒细胞的生理、病理状态及功能。无论如何，由微环境驱动的肿瘤相关中性粒细胞的功能差异几乎是确定的，充分了解这类细胞与周围环境之间的相互作用有助于更好地了解肿瘤生长和转移过程。

2 中性粒细胞的抗肿瘤作用

2.1 T细胞依赖性抗肿瘤

通常情况下，中性粒细胞的抗肿瘤作用是通过促进T 细胞活化杀伤肿瘤来实现的。SINGHAL 等［12］在肺癌早期患者体内发现一类具有抗原提成细胞特征的中性粒细胞亚群，其通过TNF 配体超家族成员4（TNF ligand superfamily member 4，TNFSF4）、TNFSF9、CD86、CD54 等分子提供共刺激信号，从而增强抗原非特异性和肿瘤特异性T 细胞反应。PONZETTA 等［13］发现活化的中性粒细胞可驱动肿瘤微环境中CD4-CD8-非常规αβ T 细胞产生IFN-γ，抑制3-甲基胆蒽（3-methylcholanthrene，3-MCA）肉瘤的生成。但是，中性粒细胞的T 细胞活化效应只存在于肿瘤早期阶段，随着肿瘤的进展，这种效应也随之减弱［14］。除了中性粒细胞本身外，中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）也能激活T细胞。NETs是由活化的中性粒细胞释放的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）-组蛋白复合物和蛋白质组成的网状结构，它能与T 细胞上的Toll 样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）相互作用，诱导转录激活蛋白3磷酸化，促进辅助性T细胞17分化［15］。

2.2 非T细胞依赖性抗肿瘤

中性粒细胞还可以通过非T 细胞依赖的方式发挥抗肿瘤作用。譬如，中性粒细胞可以通过释放活性氧、过氧化氢、TNF-α、一氧化氮合酶等直接诱导癌细胞死亡［16-18］。CUI 等［19］发现弹性蛋白酶ELANE 是人源中性粒细胞释放的主要抗癌蛋白，其可通过蛋白水解释放CD95死亡结构域杀伤多种癌细胞。另有研究发现，中性粒细胞通过促进癌细胞从子宫内膜的基底膜分离、脱落和死亡，延缓早期子宫内膜癌小鼠的恶性进展［20］。此外，中性粒细胞还能通过调节肠道菌群的平衡抑制肠癌。TRINER 等［21］发现中性粒细胞下调白细胞介素17（interleukin 17，IL17），能减少肿瘤相关细菌的扩增和肿瘤相关炎症，抑制结肠癌的增殖和侵袭。中性粒细胞也能直接杀伤肿瘤细胞，过程与其抗感染类似。中性粒细胞利用免疫球蛋白G Fc受体，通过抗体依赖性细胞毒作用（antibody-dependent cellular toxicity，ADCC）直接识别和吞噬癌细胞［22］。

综上所述，目前尽管中性粒细胞的抗肿瘤作用报道相对较少，但可以发现，中性粒细胞的抗肿瘤作用多报道在肿瘤发展的初期阶段。在这个时期，中性粒细胞被肿瘤影响，但仍保留抗肿瘤功能，其主要通过激活适应性免疫、释放细胞毒性介质、启动ADCC 过程发挥抗肿瘤效应（表1）。

表1 中性粒细胞的抗肿瘤作用及机制Tab.1 Anti-tumor effects of neutrophils and their mechanisms

3 中性粒细胞的促肿瘤作用

3.1 诱导炎症发挥促肿瘤作用

中性粒细胞的促癌作用与炎症有着密不可分的关系，可以说中性粒细胞是炎症与癌症之间联系的重要介质。一项纳入近50 万名成年受试者的前瞻性队列研究发现白细胞数量与肺癌发病风险呈正相关，而且这种关联主要是由中性粒细胞数量增加驱动［23］。COFFELT等［24］证实“γδ T细胞-IL17-中性粒细胞轴”参与乳腺癌转移过程。该研究检测到Trp53F/F乳腺癌自发性转移小鼠血清中IL17A和粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）水平升高，进一步研究发现肿瘤诱导γδ T细胞分泌大量的IL17A，而IL17A 可刺激G-CSF 高表达，从而驱动中性粒细胞的扩增和表型改变（cKIT+细胞比例增加），进而促进肺转移。此外，肥胖相关炎症以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和IL-5 依赖的方式诱导肺部中性粒细胞聚集，然后上调Cxcr2、Tlr4、S100a8、S100a9、5-脂氧合酶、还原型辅酶Ⅱ氧化酶2、前列腺素内过氧化物合酶2 等与中性粒细胞动员、活化、免疫抑制相关的基因，促进乳腺癌肺转移［25］。还有研究报道，肿瘤相关中性粒细胞可特异性上调脂肪酸转运蛋白2，使花生四烯酸加工成前列腺素E2，从而增强其促肿瘤免疫抑制特性［26］。

3.2 促进转移前生态位建立发挥肿瘤作用

早在一个世纪前，英国外科医生Stephen Paget 就提出了肿瘤转移的“种子与土壤”学说，该学说奠定了“转移前生态位”的基础。近几十年来，“转移前生态位”的学术理念得到了进一步完善。转移前生态位有利于肿瘤细胞的定植、存活、生长，而中性粒细胞是其中的关键组分。目前科学家们已经达成共识，认为中性粒细胞的积聚有助于远端器官的免疫抑制和细胞外基质重塑，促进转移前生态位建立［27］。WCULEK等［28］研究报道中性粒细胞是乳腺癌小鼠肺转移前生态位建立的主要成分和驱动因素，其衍生的白三烯通过选择性地扩增保留高致瘤潜力的癌细胞从而帮助其在远端组织定植。其中，原发肿瘤衍生物--肿瘤源性外泌体和肿瘤衍生因子是转移前生态位形成的“元凶”。肿瘤源性外泌体RNA 激活肺上皮细胞中的TLR3，诱导趋化因子分泌并促进中性粒细胞募集，这对肺转移生态位的形成至关重要［29］。另外，卵巢癌的嗜网膜性也是由于卵巢肿瘤衍生的炎症因子刺激中性粒细胞动员和NETs 的释放，形成转移前网膜生态位，从而有助于卵巢癌细胞在网膜中定植［30］。肿瘤衍生因子还可诱导肺成纤维细胞p38α 激酶的激活，在肺转移前生态位的形成和随后的肺转移中起关键作用［31］。而其机制是活化的p38α激酶上调成纤维细胞活化蛋白，促进趋化因子分泌，然后聚集大量中性粒细胞浸润肺部，从而形成转移前生态位。

3.3 释放NETs促进肿瘤进展

NETs 水平升高与多种类型癌症的进展均呈正相关［30，32-33］。NETs 能直接促进癌细胞增殖、渗出、迁移和侵袭，还能通过推动肿瘤恶性生物学过程、激活休眠癌细胞、参与转移前生态位形成等促进肿瘤的生长和转移［34-36］。在肺转移中，NETs 的作用尤为突出。有研究报道，持续的肺部炎症可诱导休眠的癌细胞周围区域形成NETs，NETs 的中性粒细胞弹性蛋白酶NE、基质金属蛋白酶9 与层黏连蛋白相互作用，唤醒肺脏中的休眠癌细胞，诱导乳腺癌复发转移［37］。中性粒细胞的一种亚型--肿瘤相关衰老中性粒细胞在早期乳腺癌的肺脏中蓄积，形成转移前生态位，促进肺转移［38］。其机制是肿瘤分泌的烟酰胺磷酸核糖基转移酶上调中性粒细胞的转录因子去乙酰化酶，促进线粒体通透性过渡孔通道开放，释放线粒体DNA，诱导线粒体依赖的NETs 形成，而NETs 捕获循环肿瘤细胞促进肺转移。

NETs 与凝血功能的相关性也突出了NETs 在癌症中的重要性。JUNG 等［39］发现胰胆管恶性肿瘤患者血浆中高水平的NETs 标志物--组蛋白-DNA 复合物和游离双链DNA 与高水平的内源性凝血酶生成潜力存在相关性。在MMTV-PyMT 乳腺癌小鼠和C57/Bl6 原位胰腺癌小鼠模型中，NETs 通过激活血小板或释放组织因子促进凝血引发癌症相关血栓［40-41］。NETosis，即NETs 的释放，是中性粒细胞的炎性死亡方式，阻断该过程能有效预防血栓的形成［42］。据报道，各种引发全身性炎症损伤的因素，包括脂多糖、烟草烟雾、肿瘤衍生的炎症细胞因子和手术应激等都会诱导NETosis，进而促进癌症患者疾病进展［32］。因此，调控NETosis 可能为抗癌症血栓形成提供新的靶点，甚至可能有助于控制癌症本身。

3.4 其他促肿瘤作用途径

除了以上促肿瘤机制，GONG 等［43］发现荷瘤鼠的中性粒细胞表达更高水平的免疫抑制相关基因，如Ptgs2、IL1β、IL10、Arg1、Arg2等，表现出强大的抑制T细胞增殖和杀伤NK 细胞的免疫抑制特性，在过继T细胞治疗中会抑制T 细胞功能，导致过继细胞疗法失败。YEE 等［44］发现中性粒细胞通过铁死亡诱导肿瘤坏死，加速恶性胶质母细胞瘤进展。肿瘤组织内部的早期坏死会诱导大量中性粒细胞浸润，其通过铁死亡杀伤肿瘤细胞，造成更多的肿瘤坏死，如此恶性循环加速胶质瘤进一步恶化。除此之外，中性粒细胞甚至能作为肿瘤转移的能量储存库。有研究报道，在乳腺癌发生转移前，肺间充质细胞以前列腺素E2 依赖性和非依赖性方式抑制中性粒细胞中脂肪甘油三酯脂肪酶的活性，诱导中性粒细胞积累脂质，这些脂质通过巨胞饮-溶酶体途径转运到转移的肿瘤细胞中，赋予肿瘤细胞更强的存活和增殖能力［45］。

总之，随着肿瘤的进展，在肿瘤及肿瘤微环境的持续影响下，中性粒细胞可向免疫抑制表型转换。这个时期的中性粒细胞可分泌或表达更高水平的炎症因子、血管生成因子、免疫抑制因子，它们通过诱导炎症、释放NETs、诱导免疫抑制、促进血管生成、强化肿瘤恶性行为等过程促进肿瘤进展（表2）。

表2 中性粒细胞的促肿瘤作用及机制Tab.2 Tumor-promoting effects of neutrophils and their mechanisms

4 中性粒细胞相关指标的临床应用探索

4.1 中性粒细胞-淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）

NLR 已被证实是多种类型癌症患者的独立预后因素［1，46］。一项包含316 例乳腺癌患者的回顾性研究评估了NLR 预测患者死亡率的有效性，结果发现NLR＞3.3 是乳腺癌患者近期和远期死亡的独立预测因素［47］。CUPP 等［48］评估了NLR 与癌症预后之间关联证据的强度和有效性，结果发现NLR升高与癌症患者的不良预后存在关联，特别是在前列腺癌、非肌肉侵袭性膀胱癌和鼻咽癌中，NLR 和总生存期（overall survival，OS）之间的关联证据最有力。此外，还有研究报道NLR≥4 的非小细胞肺癌患者接受免疫治疗后死亡风险增加［49］。值得注意的是，尽管中性粒细胞在癌症不同时期具有显著异质性，但在大部分实体瘤中，NLR 升高只与不良结局相关，无论是在癌症早期还是晚期。综上认为，NLR 作为癌症预后的生物标志物展现了较好的临床应用前景，但是其与部分类型癌症的预后关联仍存在不确定性，并且不同研究对于高NLR 阈值的定义也不相同，需要进一步研究提供更加强有力的证据评估NLR 与癌症的因果关系并测试其临床效用。

4.2 NETs

在一组接受转移性结直肠癌肝切除术的患者队列中，术后NETs 的增加与无病生存期（disease-free survival，DFS）降低相关，因此认为NETs 与手术应激后肝转移的发展有关，消除NETs 可能有助于降低肿瘤复发风险［50］。另一项研究发现，乳腺癌和结肠癌患者的肝转移灶中存在大量NETosis，血液中NETs 水平的升高可用于预测早期乳腺癌患者肝转移风险［51］。YAZDANI 等［52］在27 例接受结直肠根治术的患者中发现高水平血清MPO-DNA（NETs 形成标志物）与更短的DFS和OS显著相关。

如上所述，NETs 与血栓形成具有相关性，因此NETs 检测技术的开发与应用可能对癌症相关血栓的预测更有意义。MAURACHER 等［53］检测了984 例癌症患者血浆中NETs 的生物标志物循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）、核小体和瓜氨酸组蛋白H3（citrullinated histone H3，CitH3）的水平，其中89例患者在2 年随访中发生静脉血栓栓塞，其中肺癌和胰腺癌患者血浆的CitH3水平与静脉血栓栓塞表现出很强的相关性，乳腺癌患者有边缘性相关性，而脑癌或结直肠癌患者没有相关性。另外一项纳入957 例患者的前瞻性队列研究发现CitH3、cfDNA 和核小体水平与肿瘤患者动脉血栓栓塞症的风险无关，但是与癌症患者死亡率呈正相关［54］。

NETs 作为癌症生物标志物已成为共识，未来靶向NETosis 的临床治疗方案或将成为可能。CitH3 和CitH3-DNA 复合物是NETs 的最佳生物标志物。MPO-DNA 复合物也是较好的NETs 生物标志物，但仍存在非特异性现象［55］。目前，溶解NETs 药物，如肝素和DNA 酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）等，已经在临床使用。肽基精氨酸脱亚氨酶4 是NETs 形成必需的蛋白，其特异性抑制剂也在开发中。虽然前景光明，但是到目前为止，靶向NETs的基础和临床研究主要是以感染性疾病和自身免疫疾病为主，NETs 作为癌症治疗靶标的有效性及安全性仍需要更多的确凿证据。

4.3 中性粒细胞绝对计数

较高的肿瘤相关中性粒细胞绝对计数往往预示不良的疾病预后［56］。有研究报道中性粒细胞绝对计数与肝内胆管癌的不良无复发生存期和癌症特异性生存率相关，可用于预测疾病复发［57］。SONG等［58］分析了食管鳞癌患者围手术期中性粒细胞计数与OS 的关系，发现中性粒细胞计数≥2.6 是OS 的独立预后指标。但是，目前中性粒细胞的绝对计数与癌症预后的相关性存在很大争议，它们之间的关联证据受研究质量、异质性、小样本效应的限制，需要进一步研究打破现有证据的局限性。

目前绝大多数中性粒细胞的表型和功能研究是在动物模型中进行，而关于癌症患者体内研究证据非常有限。尽管许多研究已经证实中性粒细胞在癌症进展中的作用，但中性粒细胞如何作为靶标应用于肿瘤不同阶段的免疫疗法仍没有明确答案，需要进一步探索。

5 小结

近年来的研究揭示了中性粒细胞在肿瘤发生、生长、转移、血管生成、肿瘤相关血栓形成、免疫抑制等方面的重要作用，展现了肿瘤相关中性粒细胞的可塑性和异质性，以及其作为癌症诊断生物标志物和治疗靶点的潜力，靶向中性粒细胞的治疗方式与现有的抗肿瘤治疗方式相结合可能是有效、安全的癌症治疗策略。但是，鉴于中性粒细胞在人体中的复杂性，未来仍需更多的研究和数据才能确定调节肿瘤相关中性粒细胞表型和功能的生物标志物及其作用机制。