原花青素对雄性小鼠生殖功能损伤作用及机制

赵莹莹, 陈莉莎, 闫 丽, 王恺悦, 于月新

北部战区总医院 生殖医学科,辽宁 沈阳 110016

近年来,不孕不育症的发病率呈逐年升高趋势,全球8%～12%的育龄夫妇患有不孕不育症[1],其中,与男性有关的不育症约占所有不孕不育症的50%[2]。导致男性不育的因素有很多,主要包括生殖系统损伤、内分泌紊乱、环境污染、不良生活方式、药物引发不良反应等[3-4]。活性氧是一类具有高度活性的氧自由基的总称,包括超氧阴离子、过氧化氢、过氧自由基及羟基自由基等[5]。氧化应激主要是由于细胞内的抗氧化剂清除活性氧的能力下降或细胞内活性氧的产生过多无法及时清除,导致细胞内的抗氧化/氧化平衡失调,细胞内的自由基浓度增加,进而干扰细胞正常代谢过程[6]。有研究报道,氧化应激损伤是精子细胞功能障碍的主要原因,也是通过损伤精子结构和功能完整性而导致男性不育的主要病因,目前,氧化应激诱导精子功能下降的确切机制尚不清楚,但主要归因于轴突的过氧化损伤和细胞内ATP水平的消耗,其次是由于脂膜过氧化及细胞核、线粒体的DNA断裂而产生过量的4-羟基壬烯醛和丙二醛[7-8]。雷公藤多苷片被长期广泛用于治疗炎症和免疫疾病,其主要药理有效成分为雷公藤甲素,具有生殖毒性。过量摄入雷公藤甲素会干扰睾丸能量代谢和正常生殖功能,导致精子质量下降,睾丸萎缩,从而导致男性生殖功能障碍。有研究发现,雷公藤甲素作为化学制剂对男性生殖损伤具有较高的稳定性和重现性,而相较于物理方法和手术手段对实验动物进行造模损伤,化学方法应用于生殖障碍动物模型具有简便和成本低的优点[9]。因此,本研究选择了雷公藤甲素作为雄性不育动物模型的模型药物。既往研究发现,原花青素可激活核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)-Kelch样ECH关联蛋白1(recombinant Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)信号通路,抑制氧化应激反应[10]。本研究旨在探讨原花青素对雄性小鼠生殖功能损伤的作用及其相关机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康C57/BL6J小鼠24只,体质量18～22 g,购自辽宁长生生物科技有限公司。小鼠均饲养于SPF级实验室,温度维持在(22℃±3℃),湿度维持在45%～65%,自由饮食饮水。适应性饲养7 d后,将小鼠随机分入3组,每组各8只。对照组:小鼠灌胃或腹腔注射0.9%生理盐水。模型组:小鼠经0.9%生理盐水灌胃1 h后腹腔注射雷公藤甲素120 μg/kg。干预组:原花青素250 mg/kg灌胃处理1 h后腹腔注射雷公藤甲素120 μg/kg。连续处理28 d,每3 d给小鼠称体质量以调整灌胃和腹腔注射剂量。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 样品采集 小鼠处死前禁食不禁水12 h,以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠,分别取血和睾丸,将左右两边睾丸分别称质量,测定睾丸脏器指数;同时,收集小鼠右侧附睾进行精子分析。收集小鼠血清和右侧睾丸,放置于-80℃冰箱保存待用。

1.3 小鼠附睾精子参数测定 将整个右侧附睾置于1 ml 37℃预热生理盐水中,迅速将附睾尾剪碎,放置于37℃水浴锅中10 min,使精子从附睾小管中游出。(1)精子数量的测定:将精子悬液滴入血球计数板上,盖上盖玻片,将其置于显微镜下观察,按红细胞计数法对镜下的精子进行计数,测定小鼠的精子数量。(2)精子活力的测定:将滴有精子悬液的血球计数板于显微镜下观察,每次随机记录100个精子中具有活动力的精子数量。

1.4 酶联免疫吸附检测 对小鼠血清的生殖激素水平和氧化应激水平进行测定。测定的生殖激素主要包括睾酮、雌二醇、卵泡刺激素、黄体生成素,氧化应激指标包括丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶。检测均通过小鼠酶联免疫吸附检测试剂盒进行,严格按照说明书进行具体操作。

1.5 Western-blot检测 分别进行睾丸组织中Nrf2-Keap1蛋白的提取和总蛋白测定后,将蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜上,室温封闭1 h,一抗4℃孵育过夜。TBST漂洗3次,加入相对应二抗室温孵育1 h。TBST漂洗3次,采用ECL Western印迹试剂盒进行化学发光检测。

2 结果

2.1 3组小鼠精子参数比较 模型组小鼠精子数量和活力低于对照组,干预组小鼠精子数量和活力高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 3组小鼠精子参数比较

2.2 3组小鼠体质量及睾丸脏器指数比较 3组小鼠体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组小鼠睾丸脏器指数低于对照组,干预组小鼠睾丸脏器指数高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 3组小鼠体质量和睾丸脏器指数比较

2.3 3组小鼠血清生殖激素水平比较 模型组小鼠血清睾酮和雌二醇水平高于对照组,卵泡刺激素和黄体生成素水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);干预组小鼠血清睾酮和雌二醇水平低于模型组,卵泡刺激素和黄体生成素水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 3组小鼠血清生殖激素水平比较

2.4 3组小鼠氧化应激水平比较 模型组小鼠丙二醛水平高于对照组,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);干预组小鼠丙二醛水平低于模型组,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组小鼠氧化应激水平比较

2.5 3组小鼠睾丸组织中Nrf2-Keap1蛋白表达水平比较 模型组Nrf2蛋白和Keap1蛋白表达水平低于对照组,干预组Nrf2蛋白和Keap1蛋白表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 3组小鼠睾丸组织中Nrf2、Keap1蛋白表达水平比较

3 讨论

本研究通过对小鼠腹腔注射雷公藤甲素成功建立了雄性小鼠生殖功能损伤模型,在该损伤模型中观察到小鼠精子质量明显恶化,睾丸脏器指数降低,血清生殖激素水平紊乱,睾丸组织内触发了氧化应激改变,与既往研究[11-12]结果一致。本研究结果显示:模型组小鼠精子数量和活力低于对照组,干预组小鼠精子数量和活力高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组小鼠睾丸脏器指数低于对照组,干预组小鼠睾丸脏器指数高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组小鼠血清睾酮和雌二醇水平高于对照组,卵泡刺激素和黄体生成素水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),干预组小鼠血清睾酮和雌二醇水平低于模型组,卵泡刺激素和黄体生成素水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组小鼠丙二醛水平高于对照组,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),干预组小鼠丙二醛水平低于模型组,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组Nrf2蛋白和Keap1蛋白表达水平低于对照组,干预组Nrf2蛋白和Keap1蛋白表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。即原花青素可改善雷公藤甲素诱导的小鼠精子参数、睾丸脏器指数、生殖激素及氧化应激水平,其保护作用机制可能是通过Nrf2-Keap1通路抑制睾丸组织氧化应激。

氧化应激会通过诱导质膜过氧化损伤而引发生精功能障碍[13]。因精子富含多不饱和脂肪酸,与其他细胞相比,对氧化损伤更为敏感[14]。活性氧的产生也会降低睾丸组织中精原细胞的数量,不利于精子产生[15]。原花青素干预处理有效降低了雷公藤甲素诱导的精子质量恶化,这可能与睾丸微环境氧化应激的改善有关,表现为丙二醛水平降低、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性升高。Nrf2是一种结构复杂,在肝、脾、肾等器官中高度表达并在抗氧化体系中发挥着重要作用的蛋白[16]。原花青素可诱导Keap1半胱氨酸残基的共价修饰使其构象改变,紧密结合的Nrf2-Keap1二聚体解偶联,从而抑制Nrf2泛素化,促进其磷酸化,使游离的Nrf2进入细胞核[17]。Nrf2进入细胞核后,与Maf蛋白或Jun蛋白、Fos蛋白结合形成异二聚体,随后与ARE基因识别并结合,激活下游抗氧化酶,如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等[18]。本研究中,模型组Nrf2蛋白和Keap1蛋白表达水平低于对照组,干预组Nrf2蛋白和Keap1蛋白表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。即雷公藤甲素会降低Nrf2和Keap1的表达水平,而原花青素预处理可通过激活Nrf2-Keap1进一步增加抗氧化酶的表达。这提示,原花青素对睾丸损伤的保护作用可能与Nrf2表达上调有关。

综上所述,原花青素能够改善雄性小鼠生殖功能损伤,其机制与调节Nrf2-Keap1抗氧化系统有关。