中国莫勒菌代谢物的生物活性评价

邱振兴， 赖芃宇， 朱志强， 谭 震， 邱君志， 陈宇熹∗

(1.福州工商学院， 福建 福州 350715； 2.福建农林大学植物保护学院， 闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室/生物农药与化学生物学教育部重点实验室， 福建 福州 350002)

莫勒菌(Moelleriella)是虫生真菌的重要成员之一，该菌隶属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)麦角菌科(Clavicipitaceae)(Chaverriet al，2008)。 莫勒菌有易生产、高产孢量和高毒力等优势，被认为是一种重要的生防制剂。1921 年，Berger 使用M.libera(无性型Aschersonia aleyrodis)防治佛罗里达柑橘粉虱，这是美国首次成功使用其进行害虫生物防治(Qiuet al，2013)。 其后，许多研究相继表明，莫勒菌物种可以防治粉虱和介壳虫(Meekeset al，2002；Sengoncaet al，2006)。

在地球生物圈中，微生物扮演着极为重要的角色，与人类的日常生活存在紧密联系。 虫生真菌因其独特的生活方式和生存环境，形成了与众不同的适应寄主的特性及代谢通路。 近年来，已从虫生真菌中分离出多种代谢物(Molnaret al，2010)，次生代谢产物被认为是在真菌感染期间起着至关重要作用的毒力因素(Sbarainiet al，2016)，这些代谢产物会引起昆虫正常功能破坏、疾病甚至死亡(Aleksandraet al，2018)。

莫勒菌广泛分布于热带和亚热带地区，该类群因栖息环境和生态适应的多样性使其次生代谢产物彰显出多样性特点。 有研究表明，从莫勒菌(M.tubulata)中分离得到了多种化合物，其中杜斯塔宁和3β-乙酰基-15α，22-二羟何帕烷酮能显著抑制结核杆菌(Boonphonget al，2001)。 另有学者从莫勒菌代谢物中分离得到了1 种三萜类物质——泽渥萜(Beemelmannset al，2016)。 此外，Wattset al(2003)从莫勒菌的菌株中获得了对昆虫细胞Sf9 显示出很强的抑制作用的细皱青霉素和醌茜素，其半数抑制量(ID50)分别为1.2 和9.6 μg•mL－1。 Isakaet al(2005)从1 株莫勒菌(无性型Aschersoniasp. BCC8401)中分离到氧杂蒽酮二聚体Ascherxanthone A，此物质对疟原虫(Plasmodium falciparum)的生长有显著抑制作用，其半抑制浓度(IC50)为0.2 μg•mL－1。 Isakaet al(2010)分离到多种莫勒菌(无性型A.paraphysataBCC11964)的次生代谢产物，其中化合物Aschernaphthopyrones A 和17(21)-藿烯-6，12β-二醇对肿瘤细胞(人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞NCI-H187、口腔表皮样癌细胞KB)和疟原虫表现出较强的抑制作用，IC50分别为7.3 和15 μmol•L－1。 潘洁茹等(2007)发现1 株莫勒菌(无性型座壳孢)的代谢产物具有广谱抗细菌的活性，马慧斐等(2007)报道1 株莫勒菌(无性型座壳孢)对Raji 淋巴瘤细胞的增殖具有显著的抑制作用，Liuet al(2015)发现了莫勒菌产生的7 个新羊毛甾烷型三萜，并测试其活性，其中1-hydroxy-2-hydroxymethyl anthraquinone具有较好的抗疟效果，付德来等(2018)报道了莫勒菌含有萜类、醌类、黄酮类、甾醇和环肽等化合物并具有抗菌、抗肿瘤及杀虫等活性。 由此可见，莫勒菌及其无性型天然产物有较好的抗菌、杀虫、抗疟、抗肿瘤细胞活性，该菌在生物农药或医药应用领域存在巨大潜力。 Wattset al(2003)就11 个座壳孢菌和7 个莫勒菌代谢产物对昆虫和哺乳动物细胞毒性的安全性进行评测，结果表明，代谢物对昆虫细胞显示出较强的毒性，对哺乳动物细胞几乎无影响。 这表明，莫勒菌的代谢物相对安全，具有开发潜力。

本研究针对前期试验获得的莫勒菌纯化合物进行抗菌、抗氧化活性评价，以期发现该菌次生代谢化合物的应用价值，为其开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

链霉素和2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)购于上海麦克林生化材料有限公司；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂、超氧阴离子自由基(•)测定试剂盒、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力试剂盒和2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 试验菌株和化合物

试验菌株为中国莫勒菌(Moelleriella sinensisWYQL2017-03)，由本课题组自主分离纯化和鉴定。

用于抑菌活性评价的细菌和真菌共有12 种，均为本实验室保存菌株，大肠杆菌(Escherichia coli)、青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporumf. sp.niveum)、链格孢属(橄榄) (Alternania)、链格孢属(花生) (Alternania)、炭疽属(橄榄)(Colletrotrichum)、间座壳属(多花黄精)(Diaporthe)、拟盘多毛孢属(花生)(Pestalotiopsis)、拟盘多毛孢属(莲雾)(Pestalotiopsis)、拟盘多毛孢属(橄榄)(Pestalotiopsis)。

从中国莫勒菌的乙酸乙酯萃取物中得到的20 个纯化合物如表1 所示。

1.3 体外抗菌活性评价

在超净工作台内将供试菌株接种于150 mL 装有灭过菌的液体培养基的锥形瓶中并密封，利用恒温摇床在培养基中活化(细菌为LB 培养基，真菌为PDB 培养基)，供试细菌于恒温培养箱(28 ℃)中培养24 h 至对数期，用酶标仪测定600 nm 下的吸光度(OD 值)，换算得到相应的浓度，最终将浓度稀释至试验所需浓度1×106CFU•mL－1。 供试真菌需利用恒温培养箱(28 ℃)培养5～7 d 后，取培养好的真菌平板，用移液枪加入3 mL 无菌水，将菌丝轻轻刮取下来，使得真菌孢子悬浮于无菌水中，吸取孢子悬浮液于无菌EP 管中沉淀细小菌丝。 采用血球计数板测算孢子悬浮液的浓度，稀释至1×105个•mL－1备用。

将准备好的供试菌液用移液枪吸取196 μL 加入96 孔板的第1 孔中，第2～8 孔每孔加入菌液100 μL。 第1 孔再加入配制好的待测液体(1 mg•mL－1)4 μL，用移液枪吹打混匀，每组试验均设3 组重复，阳性对照为链霉素和环丙沙星，阴性对照为二甲基亚砜(DMSO)。

采用二倍稀释法，用移液枪吸取100 μL 第1 孔中混匀的菌液与化合物液体注入第2 孔，混匀后吸取100 μL 第2 孔液体加入第3 孔，以此类推至第8 孔，第8 孔内液体混匀后吸取100 μL，弃之。 最后在1～8 各孔中加入菌液100 μL，使每孔的总体积200 μL，对96 孔板密封处理后放置恒温培养箱培养，细菌培养24 h，真菌培养5～7 d，用酶标仪于600 nm 下测OD 值，与空白对照组作比较，吸光度下降50%时的样品浓度确定为最小抑菌浓度(MIC)。

1.4 抗氧化活性测定

1.4.1 总抗氧化能力(T-AOC)测定 根据总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒说明书配制不同浓度标准品溶液，称取27.8 mg FeSO4•7H2O，用1 mL 蒸馏水溶解，即浓度为100 mmol•L－1，将液体依次稀释至0.15、0.30、0.60、0.90、1.20 和1.50 mmol•L－1。 充分混匀后，37 ℃避光静置5 min，用酶标仪测定605 nm 处的吸光度。 各孔减去空白孔OD 值后，以标准品OD 值为横坐标，纵坐标为各OD 值对应的标准品溶液浓度，得线性回归方程y＝3.7855x－0.0627(R2＝0.9985)。 把样品测定管测得的OD 值减去空白孔OD 值后，代入标准曲线计算公式，求得总抗氧化能力。

1.4.2 超氧阴离子清除活性测定 根据抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒说明书配制样品溶液和对照溶液，将待测溶液用漩涡混匀器充分混匀，置37 ℃恒温水浴40 min，室温静置10 min，双蒸水调零，用酶标仪测定550 nm 处的吸光度(A)。 计算待测样品对超氧阴离子的抑制率。

1.4.3 DPPH 自由基清除活性测定 根据DPPH 自由基清除能力试剂盒配制样品溶液和对照溶液，将待测溶液充分混匀，室温25 ℃避光静置30 min，4000 r•min－1离心5 min 后吸取上清液，用酶标仪测定517 nm 处的吸光度(A)。 计算待测样品对DPPH 自由基清除率。

1.4.4 ABTS 自由基清除能力测定 根据ABTS 自由基清除能力检测试剂盒配制样品溶液和对照溶液，将待测溶液充分混匀，室温25 ℃避光静置6 min。 用酶标仪测定405 nm 处的吸光度(A)。 计算阳性对照的自由基清除率(DVC)和样品的自由基清除率(D)。

2 结果与分析

2.1 抑菌活性评价结果

20 个化合物中仅7 个化合物(4、5、7、8、11、12、14)表现出不同程度的抗菌活性。 20 个化合物对7 株植物病原真菌均未表现出抑制活性，对4 株细菌和1 株真菌的抑制活性如表2 所示。 化合物14 对大肠杆菌和青枯劳尔氏菌的MIC 分别为1.30 和6.25 μg•mL－1，抑菌活性超过阳性对照链霉素；化合物5 对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC 值均为10.00 μg•mL－1；化合物11 对5 株菌株均展示出不同程度的抑制活性，MIC 为6.25～25.00 μg•mL－1。

表2 中国莫勒菌代谢物的抗菌活性Table 2 Antibacterial activities of compounds from M. sinensis

2.2 抗氧化活性评价结果

采用4 种方法(超氧阴离子清除能力、DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、T-AOC总抗氧化能力)对纯化合物进行抗氧化活性评价，20 个化合物中仅化合物3、8、11、19 表现出抗氧化活性(图1－图4)。 清除自由基的能力因化合物而异，由于取代基的不同，活性也会变化。 化合物19 对超氧阴离子自由基的清除能力最高(50 μg•mL－1时抑制率为7.15%)，化合物3对DPPH、ABTS 自由基的清除能力最高(50 μg•mL－1时清除率分别为66.02%、30.75%)，化合物19 的总抗氧化能力最强(50 μg•mL－1浓度相当于0.63 mmol•L－1FeSO4的抗氧化能力)。

图1 部分中国莫勒菌代谢物对超氧阴离子自由基的清除作用Figure 1 Superoxide radical scavenging effects of some compounds from M. sinensis

图2 部分中国莫勒菌代谢物对DPPH自由基的清除作用Figure 2 DPPH radical scavenging effects of some compounds from M. sinensis

图3 部分中国莫勒菌代谢物对ABTS自由基的清除作用Figure 3 ABTS radical scavenging effects of some compounds from M. sinensis

图4 部分中国莫勒菌代谢物的总抗氧化能力(T-AOC)Figure 4 Total antioxidant capacity of some compounds from M. sinensis

3 讨论

在抗菌活性评价试验中，化合物5、11 和14 抗菌活性较为突出，化合物14 对大肠杆菌和青枯劳尔氏菌的MIC 值超过阳性对照链霉素。 化合物11 对5 株不同细菌和真菌表现出不同程度的抑制活性，具有相对广泛的抗菌活性。 对分离得到的抗菌活性物质进行分析发现，萜类化合物12、14 对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、青枯劳尔氏菌)的抑制活性明显优于革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)。 由此可见，这些化合物具有较好的应用潜力。 化合物种类不同，与细菌的相互作用机制也不同。 有研究者对化合物5 进行过初步构效关系分析，认为苯环上的羟基可能是其对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌产生抗菌活性以及甲基化的关键，羟基可能会降低抗菌活性(Huanget al，2018)。 有研究表明，某些萜类化合物可以通过破坏细菌胞内微丝结构，提高细胞膜通透性，从而达到抑菌效果，这种活性作用的强度大多受双环母核上取代基位置影响(Lyuet al，2023)；还有研究发现，酮类化合物可逆性地结合细菌的50S蛋白质亚单位，导致细菌蛋白质合成受阻。 研究表明，天然产物之所以具有抑菌活性，可能是因为多物质之间通过配伍作用发挥效果，例如头孢他啶耐药性阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)可被芹菜素(黄酮)与头孢他啶协同抑制(司旭等，2015)，这可以作为后续深入研究的方向。 从该菌次生代谢产物分离得到的酚酸类、三萜类、内脂类衍生物都有不同程度的抗细菌活性，为生物抗菌药剂的研发提供了新颖思路和科学依据。

在抗氧化能力评价中，表现出明显抗氧化活性的4 个化合物中，有3 个为萜类化合物，其中萜类化合物3(三萜)、19(二萜)抗氧化活性更为突出。 同种化合物在不同抗氧化能力评价试验中存在差异，可能是不同反应机制造成的。 超氧阴离子法、DPPH 法以及ABTS 法都是通过检测特征自由基的形成或衰减的速度或程度来评价样本活性。 以ABTS 法为例，有些化合物清除ABTS 自由基后的产物也能与ABTS 自由基反应，若如此，则测得的结果为被测化合物和反应产物与ABTS 自由基反应的总和。 而铁离子还原抗氧化剂能力(FRAP)法真正评测的是被测物将Fe3＋还原成Fe2＋的能力，还原Fe3＋的能力可以反映化合物的抗氧化能力，但是能还原Fe3＋的并不一定都是抗氧化剂，抗氧化剂不一定能有效地还原Fe3＋(王会等，2006)。 总的来说，各种测定方法都存在片面性，需要通过归纳各个结果的共性才能得到合理化评价。