肉源凝固酶阴性葡萄球菌对多环芳烃的消减作用

刘航航，潘琼，罗慧婷，蔡克周，徐宝才，李沛军

（合肥工业大学 食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009）

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一类含有两个或多个由碳原子和氢原子组成的强疏水性有机化合物，具有至少两个凝聚或融合的芳香环结构[1]。PAHs 源于有机物的不完全燃烧和热解，可以通过食物链进入人体内造成危害[2]。由于双环氧化合物的代谢激活会导致DNA 复制和突变错误从而导致癌变，PAHs 被认为对人体具有潜在的遗传毒性和致癌性，易使人体罹患乳腺癌、肺癌和结肠癌等癌症[3]。国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）已经将PAHs 分类为1 类致癌物、2A 类致癌物和2B 类致癌物[4]，其中研究较多的是1 类致癌物苯并[a]芘（benzo [a] pyrene，BaP）和2B 类致癌物苯并[a]蒽（benzo [a] anthracene，BaA）、（chrysene，CHR）和苯并[b]荧蒽（benzo [b]fluoranthene，BbFA。欧盟委员会（European Commission，EC）规定了烟熏肉制品中BaP和PAH4（BaA、CHR、BbFA 和BaP）的最大限量，分别为2.0 μg/kg 和12.0 μg/kg[5]。我国GB 2762—2022《食品安全国家标准食品污染物限量》规定，肉及肉制品中BaP 的含量不得超过5 μg/kg[6]。为减少食品中PAHs危害物对人体健康的潜在危害，降低其含量具有重大意义。

目前，对食品中PAHs 的减少措施主要集中于物理和化学方法。比较常见的物理方法有改变烟熏方式和食品原料的预处理[7]等；在化学方法方面，通过向肉制品中添加醋和啤酒等物质，利用其中酚类物质和抗氧化成分降低肉制品中PAHs[8]。然而，这些物理和化学方法大多昂贵、复杂和低效，甚至会产生有毒的次生代谢物，使这些方法往往难以推广和大规模实践[9]。与此同时，随着消费者对良好生活质量的要求不断提高，消费者更愿意接受绿色安全的方法。

近年来，通过生物学方法降解PAHs 受到广泛关注。许多细菌已被证实通过代谢或共代谢降解PAHs，并且PAHs 降解酶和生物降解途径是多样的。在环境领域，Hadibarata 等[10]研究表明白腐真菌（Armillaria sp.）F022 可以将BaP 降解为苯并[a]芘-1，6-醌，1-羟基-2-苯甲酸和苯甲酸。在食品领域，乳酸菌和凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci，CNS）是传统发酵肉制品中最主要的细菌群，它们决定了产品的感官和安全特性[11]。Bartkiene 等[12]研究了乳酸菌对冷熏猪肉香肠中PAHs 的降低效果，结果表明乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）KTU05-7、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）KTU05-9和清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）KTU05-6 均能够降低熏肠内部PAH4 含量，其中L.sakei KTU05-6 对PAH4 具有较好的去除效果。CNS 可以通过蛋白质水解和脂肪分解来促进肉制品风味的形成，还可改善肉制品色泽[13]。然而，关于其消减食品中危害物的相关报道鲜见。

本研究通过分析肉源CNS 菌株在模拟体系中对PAHs 的降低作用，筛选出消减PAHs 能力最强的菌株，并通过明确菌株消减方式、消减位置和消减关键成分，探究其消减作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PAHs 标准品（BaA、CHR、BbFA 和BaP）（纯度＞99%）：北京北方伟业计量技术研究院；链霉蛋白酶（EC 3.4.24.31）、结晶紫、阿拉伯树胶粉；上海源叶生物科技有限公司；酸水解酪蛋白、辛基苯基聚氧乙烯醚：北京索莱宝科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、布拉德福德蛋白浓度测定试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；磷酸二氢钠（NaH2PO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、乙腈、无水乙醇（均为色谱级）：国药集团化学试剂有限公司；除特殊标记外其他试剂均为分析纯。

受试菌株：木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）A2、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）C2 均分离于自然发酵风干肠，马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）E1 分离于风鸭，小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）CICC 10850：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

7.5%氯化钠肉汤（sodium chloride broth，SCB）培养基：广东环凯微生物科技有限公司；甘露醇氯化钠琼脂（mannitol salt agar，MSA）培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

洁净工作台（AlphaClean 1300）：力康精密科技（上海）有限公司；振荡培养箱（BSD-250）：上海博迅实业有限公司；台式低速离心机（TDZ5-WS）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；酶标仪（SynergH1）：美国Bio-Tek 仪器公司；液相色谱仪（S-6000）：华谱科仪（北京）科技有限公司；水浴振荡器（WE-3）：天津欧诺仪器股份有限公司；分光光度计（UV-6000PC）：上海元析仪器有限公司；静音液晶超声波清洗器（KS-7200XDS）：昆山洁力美超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株培养

在无菌环境下，用无菌接种环挑取葡萄球菌斜面上的一环菌泥，将其接入10 mL 无菌SCB 培养基中，随后漩涡振荡，将接过菌的SCB 培养基置于恒温培养箱，在恒温条件（37 ℃，150 r/min）下培养18 h 进行活化。在无菌环境下，将活化后的SCB 培养基漩涡振荡，通过无菌移液枪吸取0.2 mL 菌液接入10 mL 无菌SCB培养基中进行传代，连续传代培养2 次（37 ℃，18 h），第3 代菌液4 ℃冷藏备用。取10 mL 受试菌株第3 代菌液（1×108CFU/mL），离心（12 000×g，15 min，4 ℃）去上清液得全细胞。全细胞经无菌磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS，50 mmol/L，pH7.0）洗涤2 次，并溶解在10 mL PBS 中以获得全细胞悬液（whole cell suspension，WCS）。

1.3.2 不同菌株对PAHs 消减能力的测定

不同菌株对PAHs 消减能力的评定参照Yousefi等[14]的方法并稍作修改。在PBS 添加10 ng/mL PAHs标准品，制备得到模拟体系。即向WCS 和PBS 中添加PAHs 标准品，使其最终浓度为10 ng/mL，其中PBS 作为对照组。培养（37 ℃，150 r/min，18 h）结束后检测PAHs含量。

PAHs 含量测定参照Li 等[15]的方法并稍做修改，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）进行。待测样品经0.22 μm 滤膜过滤后，将其添加到2 mL 进样瓶中用于HPLC 检测。色谱条件：在装配荧光检测器的高效液相色谱仪上进行分离采用双流动相，A 相乙腈，B 相水。流动相洗脱梯度：0～17.5 min，40%～100%乙腈；17.5～24.0 min，100%乙腈；24.0～25.5 min，40%乙腈；25.5～27.5 min，40%乙腈。荧光检测器的激发与发射波长为BaA：274/382 nm；CHR：260/360 nm；BbFA：283/430 nm；BaP：285/410 nm。

1.3.3 S.equorum 不同细胞组分消减PAHs 能力的测定

参照Xiao 等[16]的方法并稍作修改。S.equorum WCS经超声破碎（600 W，工作2 s，间歇3 s，180 次，0 ℃）得全细胞提取液（whole cell extracts，WCE），将全细胞提取液离心（12 000×g，15 min，4 ℃）得胞内提取液（intracellular extracts，IE） 和细胞碎片。将细胞碎片溶解在10 mL PBS 中，获得细胞碎片悬液（cell debris suspension，CDS）。分别向WCS、WCE、CDS、IE 和10 mL PBS中添加PAHs 标准品，使其最终浓度为10 ng/mL，培养（37 ℃，150 r/min，18 h）结束后检测PAHs 含量。

1.3.4 蛋白酶处理对S.equorum WCE 消减PAHs 效果的影响

参照O'Brien 等[17]的方法并稍作修改。将0.1 mL链霉蛋白酶溶液添加到10 mL S.equorum WCE 中，以不添加链霉蛋白酶作为对照，水浴（37 ℃，1 h）冷却后，添加PAHs 标准品，使其最终浓度为10 ng/mL，培养（37 ℃，150 r/min，18 h）结束后检测PAHs 含量。

1.3.5 S.equorum 中PAHs 降解酶活力的测定取上述制备的S.equorum IE 样品，用于邻苯二酚2，3-双加氧酶、脂肪酶和α-淀粉酶活力的测定。

1.3.5.1 邻苯二酚2，3-双加氧酶活力

参照Xi 等[18]的方法并稍做修改。酶活性反应体系：0.2 mL 邻苯二酚（5 mmol/L），3 mL PBS（50 mmol/L，pH 8.0）和0.2 mL IE，测定其在3 min 内、375 nm 处吸光度的变化。定义每分钟1 μmoL 邻苯二酚裂解产生2-羟粘糠酸半醛所需要的酶量为1 个酶活力单位U。邻苯二酚2，3-双加氧酶的酶活力按公式（1）计算。

式中：U 为酶活力，U/mL；A 为样品吸光值；Vt为反应总体积，mL；ε 为摩尔吸光系数；t 为反应时间，min；d 为比色皿内腔厚度，cm；Vs为粗酶液体积，mL。

通过布拉德福德蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度后，用公式（1）所得结果再除以每毫升粗酶液中所含蛋白含量，即可得酶的比活力。

1.3.5.2 脂肪酶活力

参照Wang 等[19]的方法并稍作修改。底物溶液的制备方法如下：取90 mg 对硝基苯酚棕榈酸酯溶于30 mL乙腈后，将100 μL 对硝基苯酚棕榈酸酯溶液加入到900 μL 含有0.1%阿拉伯树胶和0.4% Triton X-100的50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液中。在37 ℃和150 r/min条件下孵育5 min 后，向样品中加入50 μL IE，并在150 r/min 和37 ℃条件下再孵育5 min。用300 μL 的10% Na2CO3终止反应。混合物经离心后测量410 nm处的吸光度。定义在37 ℃条件下，每分钟释放1 μmol对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的酶量为1 个酶活力单位U。脂肪的酶活力按公式（2）计算。

式中：U 为酶活力，U/mL；A1为样品吸光值；A0为样品空白吸光值；K 为对硝基苯酚标准曲线的斜率；C0为对硝基苯酚标准曲线的截距；n 为稀释倍数；V1为反应液体积，mL；V2为粗酶液体积，mL；t 为反应时间，min。

通过布拉德福德蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度后，用公式（2）所得结果再除以每毫升粗酶液中所含蛋白含量，即可得酶的比活力。

1.3.5.3 α-淀粉酶酶活力

参照Božic等[20]的方法并稍作修改。采用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定α-淀粉酶活力。将含有100 μL IE 和400 μL 1.0%可溶性淀粉的反应混合物在PBS（50 mmol/L，pH7.0）中孵育（40 ℃，30 min）。通过加入1 mL DNS 试剂停止反应，然后将混合物煮沸5 min，冷却至室温并用蒸馏水稀释。淀粉水解过程中释放的还原糖量通过葡萄糖标准曲线测定。定义在40 ℃、pH7 条件下，每分钟淀粉水解产生1 mg 葡萄糖所需要的酶量为1 个酶活力单位U。α-淀粉酶的酶活力按公式（3）计算。

式中：U 为酶活力，U/mL；m 为葡萄糖质量，mg；n为稀释倍数；V 为反应所用淀粉酶原液体积，mL；t 为反应时间，min。

通过布拉德福德蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度后，用公式（3）所得结果再除以每毫升粗酶液中所含蛋白含量，即可得酶的比活力。

1.3.6 热失活S.equorum 对PAHs 消减作用的影响

参考Yousefi 等[14]的方法对S.equorum 进行热处理。WCS 经热处理（100 ℃，15 min）冷却后，添加PAHs标准品，使其最终浓度为10 ng/mL，对照组不经热处理直接添加PAHs 标准品。培养（37 ℃，150 r/min，18 h）结束后通过离心（12 000×g，15 min，4 ℃）去除细胞，收集上清液用于检测PAHs 含量。

1.3.7 S.equorum WCE 的傅里叶变换红外光谱分析

参照Peng 等[21]的方法并稍做修改。S.equorum 的WCE 经冻干机冻干后，采用傅里叶变换红外光谱仪进行光谱扫描，扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.4 数据处理

试验重复3 次，结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 25.0 软件对数据进行分析，各数据之间的显著性差异（P<0.05）使用Duncan's 多重分析法进行检验，利用Origin 2017 作图。

2 结果与分析

2.1 不同CNS 菌株对PAH4 的消减效果

食品中将包括BaP 在内的16 种多环芳烃列为食品系统的主要污染物，欧洲食品安全委员会（EFSA）建议用PAH4（BaA、CHR、BbFA 和BaP）代表食品中多环芳烃的产生和毒性水平，因此本研究将PAH4 作为筛选菌株的依据。在模拟体系中接种不同菌株对PAHs的消减效果见图1。

图1 不同菌株对PAH4 降低量的影响Fig.1 Effects of different bacteria on PAH4 reduction

由图1 可知，接种组中PAH4 含量均显著低于对照组（P<0.05），即4 种葡萄球菌菌株均能显著降低模拟体系中的PAH4（P<0.05）。S.xylosus A2、S.carnosus C2、S.equorum E1 和S.vitulinus CICC 10850 对BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分别为3.63%～12.14%、3.86%～8.69%、12.71%～17.11%和6.21%～15.12%。在所有待测菌株中，S.xylosus A2 和S.carnosus C2 降低PAH4 能力最弱，S.equorum E1 降低PAH4 能力最强，S.equorum E1 对BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分别达到15.79%、17.11%、13.54%和12.71%。不同的葡萄球菌菌株对PAHs 表现出不同的消减效果，这与Zhao等[22]的结果类似，他们的研究表明，15 株乳酸菌均可去除无菌蒸馏水中的BaP，去除率为11%～67%。这主要由菌株特异性造成。后续试验以降低PAH4 能力最强的S.equorum E1 为研究对象，探究其对PAHs 的消减机理。

2.2 不同细胞组分对消减PAH4 的影响

为了明确S.equorum 各细胞组分对PAHs 的消减效果，比较了WCS、WCE、IE 和CDS 对PAHs 的消减效果。S.equorum 的WCS、WCE、CDS 和IE 对PAH4 降低率见图2。

图2 S.equorum 的WCS、WCE、CDS 和IE 对PAH4 降低率Fig.2 The reduction rate of PAH4 treated with the WCS，WCE，CDS and IE of S.equorum

如图2 所示，WCS 组对BaA、CHR、BbFA 和BaP的降低率分别为15.79%、17.11%、13.54%和12.71%。WCE 组对BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分别为20.00%、19.98%、13.65%和14.00%，WCE 组对BaA 和CHR 的降低率显著高于WCS 组（P<0.05），这表明超声破碎处理提高了S.equorum 对PAHs 的降低效果，可能是超声处理使细胞中更多的消减物质暴露，PAHs更容易与消减物质接触作用的结果。Yousefi 等[14]研究发现超声处理可以改变细胞壁结构、增加其通透性，从而增加肽聚糖的可利用性，使细胞壁上产生新的结合位点。可见，S.equorum 对PAHs 的消减可能与物理吸附途径同时存在。WCE 组对PAH4 的降低率和CDS组不存在显著差异（P>0.05），但显著高于IE 组（P<0.05），这表明细胞碎片和细胞内物质都具有消减作用，从IE组的消减效果可得，S.equorum 对PAHs 的消减可能存在生物降解途径。与本研究结果类似，Zhao 等[22]研究表明植物乳杆菌（L.plantarum）CICC 22135 和戊糖乳杆菌（L.pentosus）CICC 23163 肽聚糖在去除BaP 中起重要作用，并且细胞结构完整程度影响BaP 去除效率。

2.3 S.equorum 生物降解PAH4 关键消减成分的确定

在生物降解PAHs 时，细菌中有多种酶及其蛋白质产物参与细菌对PAHs 的降解。为了确认S.equorum中蛋白质类物质（酶和蛋白质产物）是否在消减PAHs中起关键作用，探究蛋白酶处理对S.equorum 消减PAHs 的影响。蛋白酶处理前后S.equorum 对PAH4 的消减效果如表1 所示。

表1 蛋白酶处理对S.equorum 消减PAH4 的影响Table 1 Effects of protease treatment on PAH4-decreasing ability of S.equorum

对照组（未经蛋白酶处理）对BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分别为20.00% 、19.98% 、13.65% 和14.00%，蛋白酶处理组对BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分别为11.53%、13.77%、7.55%和1.61%。经蛋白酶处理后，S.equorum 对PAH4 消减能力显著下降（P<0.05），由此表明S.equorum 细胞片段上蛋白质类物质（酶和蛋白质产物）在消减PAHs 过程中起重要作用。Xiao 等[16]在探究戊糖乳杆菌R3 对N-亚硝胺降解时，发现其表层蛋白能显著降低N-亚硝胺含量（P<0.05）。

2.4 S.equorum 生物降解PAH4 关键酶的探究

生物降解是在高度污染环境中去除PAHs 的主要途径，Chen 等[23]研究表明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）降低PAHs能力主要取决于它们是否具有参与芘降解的关键酶。已有研究表明，邻苯二酚2，3-双加氧酶（C23O）、脂肪酶和α-淀粉酶都与PAHs 和烃类化合物的代谢有关[23-25]。C23O 是超二醇双加氧酶家族的成员，催化邻苯二酚和取代邻苯二酚环的裂解效应。Karimi 等[24]研究发现细菌产生的淀粉酶和商业淀粉酶均能降解烃类化合物。脂肪酶在油性烃类的生物降解中也起重要作用[25]。因此，通过检测S.equorum 中关键酶（C23O、脂肪酶和α-淀粉酶）的活性可以初步判断PAHs 降解代谢途径。

在S.equorum 中检测到3 种酶活性如图3 所示。

图3 S.equorum 中C23O、脂肪酶和α-淀粉酶的比酶活Fig.3 Specific activity of C23O，Lipase and α-amylase in S.equorum

由图3 可知，C23O、脂肪酶和α-淀粉酶的比酶活分别为56.65、266.92、3.31 U/mg，其中脂肪酶活性最高（P<0.05），这表明S.equorum 可能通过产生这些关键降解酶来降解PAHs。

2.5 热失活S.equorum 对PAH4 的物理吸附作用

为了明确S.equorum 对PAHs 的去除是否存在物理吸附途径，研究了细胞活性对消减PAHs 的影响，结果见表2。

表2 细胞活性对S.equorum 消减PAH4 的影响Table 2 Effect of cell viability on PAH4-decreasing ability of S.equorum

由表2 可以看出，对照组对BaA、CHR、BbFA 和BaP的降低率分别为15.79%、17.11%、13.54%和12.71%，热处理组对BaA、CHR、BbFA 和BaP 的降低率分别为28.77%、30.52%、25.41%和27.38%，S.equorum 经热处理后对PAH4 的降低能力显著提升（P<0.05），这与Yousefi 等[14]的结果一致。Zhu 等[26]研究指出热处理提高了乳酸菌对酚甲烷的结合去除能力。结合本研究结果可知，S.equorum 在热处理后可能改变了细菌细胞壁结构，从而产生新的结合位点，增加了细胞对多环芳烃的吸附。Zhao 等[22]认为乳酸菌对BaP 的去除不存在生物代谢，在PAHs 去除过程中细胞活性是不必要的。

2.6 S.equorum 对PAH4 的吸附官能团分析

通过FTIR 分析S.equorum 的WCE 以识别与PAHs结合相关的潜在官能团和可能的结合位点，获取PAHs 消减过程中涉及官能团的更多信息结果见图4。

图4 S.equorum 全细胞提取液的傅里叶红外分析Fig.4 Fourier transform infrared spectrum of the whole cell extracts of S.equorum

如图4 所示，根据文献[27]报道对L.pentosus R3主要吸收谱带进行归属：3 280.66 cm-1（—OH 的伸展振动吸收）；2 927.14 cm-1（C—H 键的不对称伸缩振动吸收）；1 642.19 cm-1（酰胺Ⅰ带中的C O 伸缩振动吸收）；1 543.17 cm-1（酰胺Ⅱ带中的N—H 键的弯曲振动吸收和C—N 键的拉伸）；1 395.67 cm-1（羧基的对称伸缩振动）；1 230.79 cm-1（脂质和多糖P O 的伸缩振动）；1 062.49 cm-1（肽聚糖C—O 的伸缩振动）。939.34 cm-1（羧酸面外弯曲振动吸收）；858.30 cm-1（C—H 面外弯曲振动吸收）。Xiao 等[28]表明官能团（羟基、胺基等）除了引发范德华力，还可以引发各种分子水平的相互作用，这些基团在白腐真菌吸附PAHs 过程中也发挥重要作用。此外，这些化学基团存在于多糖、蛋白质和核酸等物质中，一些脂肪族和芳香族成分可能有助于S.equorum 对PAHs 物理吸附。

3 结论

在模拟体系中，受试4 株CNS 菌株对PAHs 都具有消减作用，其中S.equorum 效果最好。进一步分析发现，S.equorum 的WCS、WCE、IE 和CDS 对PAHs 均具有消减效果，且WCE 和CDS 对PAHs 消减效果最强（P<0.05）。蛋白酶处理使S.equorum WCE 对PAH4 消减能力显著降低（P<0.05），说明S.equorum 关键消减物质为蛋白类物质；同时，在WCE 中检测到PAHs 关键降解酶活性，表明S.equorum 消减PAHs 存在生物降解途径。热灭活处理使S.equorum 对PAH4 消减能力显著提升（P<0.05），说明S.equorum 消减PAHs 存在物理吸附途径，并且—OH、C O、N—H、C—N 等官能团参与了物理吸附过程。因此，S.equorum 可以通过物理吸附和生物降解两种作用途径消减PAHs。