高效液相色谱中流动相的甲醇乙腈比例探讨

张智怡，程冬冬，罗少辉*

（1.江西省检验检测认证总院，江西南昌，330052；2.江西省检验检测认证总院检测认证技术发展研究院，江西南昌，330029）

0 引言

反相液相色谱有机流动相的研究，对高效液相色谱分析领域的发展而言具有非常重要的意义。对将甲醇和乙腈作为流动相的各种比例检测标准进行实验研究，以此探究解决高效液相色谱中存在的疑难杂症的方法，从而提高检测效率并节约成本。

在实际检测工作中，我们会同时收到大量样品，然而参照国标、行标或企标时发现，标准制定者往往没有考虑到一线检测人员需要频繁更换流动相，导致实际工作量巨大的问题。我们通过试验，试图统一甲醇和乙腈流动相（体积比）。统一甲醇和乙腈流动相（体积比）不仅能够大大减轻一线检测人员的工作负担，而且对高效液相色谱分析具有积极推广的意义。

经查阅大量国内外高效液相色谱流动相相关文献［1-8］，目前只零星发现有甲醇乙腈混合流动相检测标准，尚未发现通用有机流动相、黄金混合比例的提法。本项目试图统一反相色谱流动相中的有机相。根据现有的实验成果，再通过大量试验数据证明其普遍性、通用性后，很多国标和企标检测方法将得到修正、补充和参考，这对于分析化学领域和标准制定领域来说具有非常重要的意义。

1 研究内容和目标

1.1 研究内容

本文研究甲醇和乙腈作为流动相配比时的特性。

使用通用有机流动相方法，采用最简单、基本的高效液相色谱仪对三种常见农药进行色谱和含量分析。

1.2 研究目标

1.2.1 有机流动相的甲醇乙腈的配比值为3：2 的通用性验证

通过研究甲醇和乙腈的体积比V甲醇：V乙腈=3：2 标准有机流动相在实际检测中的通用性，缩短检测时间，提高检测效率，节约流动相成本，将出峰异常率降到最低，免去摸索各种适合条件的时间。

1.2.2 有机流动相在农药检测中的运用

通过研究甲醇和乙腈的体积比V甲醇：V乙腈=3：2 标准有机流动相在实际检测中的通用性，用梯度分析法改变流动相比率和检测波长，建立多种农药出峰时间，准确得出检测结果。

1.2.3 有机流动相的拓展运用

通过研究甲醇和乙腈的体积比V甲醇：V乙腈=3：2 标准有机流动相在实际检测中的通用性，推广至分析检测其他应用领域，如化工生产、食品药品监督、保健品、生物化学研究等。

2 研究方法和技术路线

2.1 甲醇乙腈混合流动相洗脱能力配比分析

参考大量文献［9-11］，根据研究甲醇乙腈极性及大量实验数据，本项目统一有机流动相标准为A 体积比（甲醇：乙腈=3：2），以下简称A 体积比（通用），甲醇大致相当于89%乙腈的洗脱能力，故以此比例换算纯甲醇或纯乙腈作为有机流动相检测标准。

例：①当检测标准为体积比A（甲醇）：B（水）=80：20 时，我们用通用有机流动相换算公式体积比 A（通用）=［0.4A（甲醇）］×89%+0.6A（甲醇）=0.956A（甲醇），采用本项目通用有机流动相后的有机相体积比A（通用）：B（水）=76.48：23.52 ≈76.5：23.5。

②当检测标准为体积比A（乙腈）：B（水）=80：20时我们用通用有机流动相换算公式体积比A 通用=0.4A（乙腈）+［0.6A（乙腈）］ ÷89%=1.074A 乙腈，修正后体积比A（通用）：B（水）=85.92：14.08 ≈86：14；当分离情况不佳时，可根据检测仪器和色谱柱特性适当调低有机流动相比例。

2.2 混合流动相在农药检测中的运用

选出几种具有代表性的三种农药产品噻呋酰胺、噻虫·吡蚜酮和嘧菌酯进行试验。

2.3 混合流动相在国标等方面的运用拓展前景

用通用有机流动相对上述农药国标（行标、企标）检测方法进行修正后，将两种方法检测结果进行比对。

2.4 混合流动相的准确性、通用性验证

基于通用有机流动相，采用梯度法对上述部分农药混合标样进行检测，包括渐变流动相比例和检测波长，建立各组分出峰时间表和DAD 数据库，通过大量数据来证明V甲醇：V乙腈=3：2 的通用有机流动相液相色谱分离法的准确性和通用性。

3 试验部分

3.1 试验条件

Agilent 1200 高效液相色谱仪（具可变波长紫外检测器）；250×4.6 mm（i.d.）色谱柱；不锈钢柱（内装Tc-C18 填料）；流速1 mL/min；进样体积20μL。

3.2 混合流动相运用在噻呋酰胺的检测

在企业标准实验条件下（检测波长225 nm）检测混配悬浮剂（噻呋酰胺溶度约0.1 g/L ，己唑醇溶度约0.03 g/L 的甲醇混合溶液）时，噻呋酰胺出峰时间在7.087 min，己唑醇出峰时间在11.740 min，但保留时间在2.420 min 时出现了噻呋酰胺鼓峰问题（见图1），这可能是由于流动相（甲醇：水=75：25）的种类和组成比造成的。而经试验改用优化后的通用有机流动相（有机相：水=70：30，有机相为V甲醇：V乙腈=3：2 混合溶剂）能解决此问题（见图2），噻呋酰胺出峰时间在9.968 min，己唑醇出峰时间在14.474 min，噻呋酰胺鼓峰几乎消失（可忽略不计），并且提高了检测精密度。对比图1 和图2，发现在其他试验条件不变的情况下，仅改变流动相的种类和组成，可以修正噻呋·己唑醇典型色谱图的前鼓峰问题。

图1 企业标准实验条件下φ（甲醇：水）=75：25 检测噻呋·己唑醇标准样品典型色谱图

图2 通用有机流动相实验条件下φ：（有机相：水）=70：30 检测噻呋·己唑醇标准样品典型色谱图

3.3 混合流动相在检测噻虫·吡蚜酮的运用

采用国标法（检测波长265 nm）检测噻虫·吡蚜酮（噻虫嗪和吡蚜酮溶度均约0.1 g/L 乙腈水混合溶液）时，以φ（乙腈：水）=10：90（水为0.2 g/L 磷酸二氢钾溶液）为流动相，吡蚜酮的保留时间为4.244 min，噻虫嗪的保留时间在7.955 min，但色谱图会出现三叉鬼峰（见图3），这可能与流动相的极性有关，也可能是样品预处理时发生了降解。而采用本项目通用有机流动相后，吡蚜酮的保留时间为13.155 min，噻虫嗪的保留时间在17.742 min（见图4），尽管保留时间有所延长，但能有效地将噻虫嗪和吡蚜酮彻底分离，消除多余杂峰，并且成功解决了三叉鬼峰问题，计算结果也能控制标准范围内。

图3 采用国标法实验条件下：流动相φ（乙腈：水）=10：90（水为0.2g/L 磷酸二氢钾溶液）检测噻虫·吡蚜酮标准溶液时鬼峰色谱图

图4 采用通用有机流动相φ（有机相：水）=18：82（有机相为甲醇和乙腈3：2 混合溶剂，水为0.2 g/L 磷酸二氢钾溶液）检测噻虫·吡蚜酮标准溶液时典型色谱图

3.4 混合流动相在检测嘧菌酯水分散粒剂中的运用

采用《嘧菌酯水分散粒剂》（HG/T 4931—2016）检测25%嘧菌酯（嘧菌酯约0.1 g/L 乙腈水混合溶液），以φ（乙腈：水）=45：55（水为pH=2.5 的磷酸水溶液）为流动相，嘧菌酯在19.183 min 出峰，同时出现一杂峰且拖尾（见图5），严重影响了目标物质的分离度、灵敏度和定量。造成这种现象的原因可能是样品中含有其他未知化合物。而采用本项目通用有机流动相，并调整流动相有机溶剂与水的体积比后，嘧菌酯保留时间在23.066 min（见图6），嘧菌酯主峰与拖尾杂峰分离，所得结果较行标法更为精确。

图5 采用行标HG/T 4931-2016：φ（乙腈：水）=45：55（pH=2.5磷酸水溶液）检测嘧菌酯试样典型色谱图

图6 采用通用有机流动相φ（有机相：水）=50：50（pH=2.5 磷酸水溶液）检测嘧菌酯试样典型色谱图

3.5 混合流动相在检测24 种非法添加农药运用

对国标方法中流动相的组分和体积比进行条件试验（流量1.0 mL·min-1，最大压力400.0 bar），通过调整甲醇和乙腈的体积比进行混合标样梯度法试验（见表1），建立24 种高频非法添加农药（24 种标样含量均为约0.04g/L 甲醇水混合溶液）色谱图（见图7~10）。对比图7~10 结果，图9 分离效果最好，拖尾峰最少，重峰最少。24 种农药在通用有机流动相（V甲醇：V乙腈=3：2）出峰顺序（图9 所示）：6.536 min 甲胺磷；8.305 min 乙酰甲胺磷；14.195 min 吡蚜酮；15.391 min 灭多威；16.018 min烯啶虫胺；17.954 min 噻虫嗪；21.550 min 吡虫啉；24.124 min 啶虫脒；32.332 min 克百威；33.290 min 福美双；39.755 min 氯虫苯甲酰胺；43.540 min 毒死蜱；47.386 min 氟虫腈；51.368 min 辛硫磷；54.883 min氟铃脲；57.570 min 溴虫腈；59.765 min 唑虫酰胺；62.696 min 虱螨脲；70.418 min 丁醚脲；72.380 min 螺螨酯；78.455 min 阿维菌素；79.120 min 联苯菊酯；84.357 min 氟虫脲；92.740 min 丁硫克百威。

表1 A（有机相）：B（水）流动相洗脱梯度

图7 梯度法甲醇-水的24 种农药混合标样色谱图

图8 梯度法乙腈-水24 种农药混合标样色谱图

图9 梯度法有机相（V甲醇：V乙腈=3：2）-水24 种农药混合标样色谱图

图10 梯度法有机相（V 甲醇：V 乙腈=8：2）-水24 种农药混合标样色谱图

3.6 实验综述

对嘧菌酯、噻虫·吡蚜酮、噻呋·己唑醇三种农药样品采用国标法、企标法和行标法进行检测的时间与本项目通用有机流动相检测时间进行对比，最终统计出国标法和企标法为12 小时左右，通用有机流动相方法为6小时左右，其中国标法和企标法消耗的大量时间集中在更换流动相时的洗柱时间，并且检测噻虫·吡蚜酮时条件不适合，摸索条件浪费了大量时间。由此可知，本次试验优化的通用有机流动相（V甲醇：V乙腈=3：2）对于提高上述三种典型农药有效成分、食品农药残留、农药隐性添加成分的检测效率有明显作用。

4 结论

本文以高效液相色谱法中流动相甲醇和乙腈的比值，从通用有机流动相的角度，建立一个完善的黄金有机流动相（V甲醇：V乙腈=3：2）检测标准体系，对国标（行标、企标）起到修正、参考、补充作用。甲醇乙腈黄金配比有机流动相能大大提高检测效率和检测准确度，降低检测成本，用在复杂组分梯度法定性时，还降低了检测门槛。因此，甲醇乙腈黄金配比有机流动相的实用前景非常广阔。而专注于研究检测方法的通用性，对于分析化学液相色谱仪器检测领域研究具有重要的实际意义。