基于新抗原筛选的肿瘤疫苗改造策略研究进展

赵董丽，朱影，黄常新

1.浙江中医药大学第四临床医学院，浙江杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第一医院肿瘤科，浙江杭州 310000；3.杭州师范大学附属医院肿瘤科，浙江杭州 310000

肿瘤细胞基因组突变可转录、翻译产生异常蛋白质，异常蛋白质酶解生成的异源性肽与正常细胞表达的氨基酸序列并不一致，其可被抗原提呈细胞中的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）所识别，MHC可将抗原肽提呈至抗原提呈细胞表面，供T细胞受体（T cell receptor，TCR）所识别和活化，最终激活细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）发挥特异性抗肿瘤免疫反应。自肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原等相关研究开展至今，抗原的发现与抗原改造便如影随形，成为基于抗原肽抗肿瘤免疫治疗中最主要的两大问题。

1 肿瘤新抗原的鉴定筛选技术

肿瘤新抗原的体外筛选是将肿瘤组织全外显子测序、转录组测序、蛋白质谱、T细胞组库测序、计算机机器学习预测新抗原与体外实验等技术联合，鉴定具有抗肿瘤免疫效应的高效肿瘤新抗原，见图1。

图1 肿瘤新抗原的体外筛选技术

1.1 外显子测序技术

研究人员使用高通量测序技术，将肿瘤细胞中的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）与正常健康组织进行比较，找到肿瘤患者个体化的非同义突变，以预测肿瘤特异性新抗原。2017年，Sahin等[1]首次将个体化突变体疫苗应用于人体，通过外显子测序技术全面识别个体突变，设计和合成针对黑色素瘤患者的个体化肿瘤疫苗，结果发现所有接种该疫苗的受试者体内均产生强大且高效的特异性抗肿瘤T细胞应答，5例转移瘤患者中的2例患者表现出与疫苗相关的客观缓解，此研究开辟新抗原免疫治疗道路。

外显子测序技术的测序数据量大、测序深度高，测序技术已较为成熟，检测到的突变基因较可靠，已在临床和科研中广泛应用。但RNA转录、蛋白质翻译修饰及后续酶解等一系列“黑箱”过程中的不可预知性也极大地制约其应用。

1.2 蛋白质谱技术

基于蛋白质谱技术从肿瘤细胞表面分离人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）结合的肽段是鉴定HLA限制性新抗原的可靠方法。Bassani-Sternberg等[2]率先应用先进的质谱技术直接从黑色素瘤患者的原始肿瘤组织中找到突变的肽配体，这些肽段被认为是与肿瘤免疫治疗策略高度相关的真正新表位。Chong等[3]利用基于质谱技术的分析方法表征非常规的HLA肽库，该方法可准确鉴定数百种共享的肿瘤特异性非常规HLA肽。

质谱技术可鉴定数以千计的非典型多肽，大多数非典型多肽来自于蛋白质编码区域以外序列或由非典型抗原加工产生[4-6]。这反映从基因表达到蛋白质翻译，再到蛋白酶体酶解为抗原肽等过程需经历漫长“幕后”操作，但因大多数抗原表位与HLA结合时间较短，洗脱时易发生分离，质谱技术检测突变多肽的敏感度较低、假阴率较高，且质谱技术对样本要求较高，单纯依靠质谱技术鉴定与HLA结合的肽段，很难全面获取真实表达的新抗原。

1.3 T细胞测序技术

鉴于程序性死亡蛋白1单抗抗肿瘤免疫治疗的显著获益，TCR等表面分子已成为有发展前景的生物标志物[7]。TCR表达的丰度差异可部分解决新抗原筛选、肽加工和MHC呈递候选表位靶标的临床实用性考量等问题，从而辅助疫苗设计[8]。

作为基于新抗原等多种免疫治疗的生物标志物，TCR可间接反映新抗原能否引起特异性抗肿瘤免疫应答及应答的程度，其具有敏感度高且所需样本较少等特点，并可应用于新型TCR或嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）的工程化免疫细胞治疗等领域。TCR应用的主要问题是其在免疫应答过程中的动态变化，仅靠瞬时检测结果缺乏客观准确性，且现阶段无法仅靠TCR准确预测新抗原表位，测序费用较高，故其尚未在临床得到广泛应用。

1.4 计算机新抗原预测技术

随着生物信息学、人工智能和机器学习的日益发展，计算机预测新抗原成为可能。目前，常用的数据库是将HLA-配体组数据整合到机器学习算法（如线性回归和人工神经网络）中，采用大量的训练集和测试集以提高HLA等位基因型限制性新抗原预测能力，主流的预测数据库包括NetCTL和NetCTLpan[9]。pMHC复合物能否被TCR识别是至关重要的预测因素，T-Scan作为一种TCR表位扫描方法，可系统鉴定T细胞有效识别的抗原，高通量发现和分析CTL的靶标，这非常有助于研究候选新抗原的免疫原性，为免疫治疗提供新靶点[10]。

数据库预测简单便捷，但仅靠数据库预测新抗原存在着大量与体外实验不一致的结果，仍需更全面的肽表位信息及体外实验验证结果提高计算机预测的精度。

2 有效抗原表位的特征

免疫系统不仅能通过免疫监视消除肿瘤，也能通过免疫编辑促使肿瘤复发转移。基于此，肿瘤细胞会掩盖其免疫原性特征，并诱导出利于免疫抑制的肿瘤微环境[11]。因此，鉴定并应用高免疫原性的特异性肿瘤抗原表位，才能有效预防肿瘤逃逸的发生，见图2。

图2 有效抗原表位的特征

2.1 MHC限制性肽表位的残基特征

2.1.1 抗原表位的HLA锚定残基特征 Robbins等[12]将黑色素瘤细胞系2098上表达的3种突变抗原鉴定为TIL2098的3个靶标，对应的特异性过继细胞治疗使得肿瘤发生消退，并在这一过程中发现靶标之一的酪蛋白激酶1α1中作为主要锚定位点之一的第2位残基由丝氨酸突变为亮氨酸后，酪蛋白激酶1α1肽与HLA-A * 0201结合亲和力提高近10倍。另有研究发现，HLA配体的氨基端或羧基端特定位置上常存在某些氨基酸的显著富集和（或）耗尽现象。如在HLA-Ⅱ配体中，酪氨酸常在配体两端的序列中显著富集，而组氨酸和脯氨酸通常在这些区域中缺失[13]。在HLA-Ⅰ配体中，丙氨酸、赖氨酸、丝氨酸和精氨酸常在配体羧基端显著富集，而脯氨酸在配体两端耗尽，同时酸性残基和某些疏水残基在HLA相关肽下游表达不足[14]。研究者们所观察到的肽侧翼特征可反映蛋白酶的切割偏好，有利于肿瘤疫苗的研制。

2.1.2 残基特定表达与免疫原性的关系 MHC结合预测工具对25%的含半胱氨酸表位的抗原肽预测亲和力均低估至1/3甚至更多[15]，另有研究发现，色氨酸耗竭所导致的色氨酸-苯丙氨酸替代物可扩大细胞表面呈递的抗原表位，以激活T细胞反应[16]。这些特定氨基酸残基的特征可有效应用于抗原肽的改造。

2.1.3 抗原表位残基修饰的特征 Bassani-Sternberg等[17]在利用质谱洗脱的免疫肽段中检测到大量的磷酸化HLA多肽，发现78%的磷酸化发生在丝氨酸上，且这种修饰在HLA-Ⅰ配体的9-11肽第4位最为突出，同时发现检测到的磷酸化HLA多肽中有一个非常保守的基序，其第1位氨基酸残基（P1）首选精氨酸和赖氨酸，第4位氨基酸残基（P4）为磷酸化位点，该基序可增加低亲和力肽HLA结合力，并通过P4的磷酸化向TCR直接呈递磷酸化位点提高免疫原性。

在基于人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）肿瘤疫苗研究中发现，自身免疫耐受可阻止HER2疫苗诱导更持久高效的抗肿瘤免疫；但在通用T细胞表位中引入对硝基苯丙氨酸可打破HER2的自我耐受，诱导强烈的HER2特异性体液免疫和细胞免疫，显著抑制HER2+B16F10肿瘤细胞的生长[18]。这对开发治疗性癌症疫苗具有重要意义。

2.2 肽表位的固有特性与HLA相互作用

研究发现，HLA等位基因偏好于九肽的肽配体，这些HLA等位基因结合位点更优先允许这些短肽嵌入到其“口袋”中；同时，同源肽的高表达丰度可提高MHC-肽的结合稳定性[14]。另有研究表明，TCR接触残基的疏水性是免疫原性表位的标志，暴露疏水结构域可显著提高蛋白酶体降解和MHC呈递的速度[19]。以上这些特点可为肿瘤疫苗的研发改进提供重要的可行性依据。

2.3 复杂的变异结构

融合蛋白、剪接异构体、突变基因的异常表达内含子等复杂的变异结构可能是高免疫原性抗原肽的主要来源。相当大比例的HLA结合肽可通过剪接/融合来自一个或两个不同蛋白质的不连续肽片段而产生[20-21]。在剪接肽中，半胱氨酸残基常在剪接肽的裂解位点富集，对抗原肽的制备意义重大[22]。

多项研究证实，复杂变构对新抗原的制备具有重大意义和应用价值。Yang等[23]在一位头颈部鳞状细胞癌患者中发现DEK-AFF2融合衍生的九肽，其在免疫治疗反应期间出现DEK-AFF2特异性T细胞反应。Hoyos等[24]研究发现，异常剪接衍生的外显子-外显子连接产生的抗原肽具有MHC-I结合潜力，有望作为肿瘤新抗原。

3 基于免疫原性的肽表位改造

3.1 抗原表位的残基替换

将位于黑色素细胞上的酪氨酸酶相关蛋白2抗原表位与HLA-A*0201分子作用的位点进行残基替换，替换后肽段的亲和力和稳定性有所提升，其对T细胞的刺激活化能力及对肿瘤细胞的杀伤能力均优于野生型酪氨酸酶相关蛋白2表位[25]。Uchtenhagen等[26]研究发现，黑色素瘤相关表位gp10025-33的第3位置（p3）P修饰（将肽位置3替换为脯氨酸）可直接提高该表位与TCR的亲和力。抗原肽结合基序的氨基端锚定位点（主要是p2和p3）对稳定pMHC-I复合物起关键作用[27]。抗原肽p2以酪氨酸代替天冬氨酸，或在氨基端用亮氨酸代替脯氨酸/精氨酸可加固肽的构象稳定性以利于MHC结合的肽[28]。依据残基间的pi-pi堆砌相互作用对单残基进行替换，特别是p9（如p9F和p9W）被替换后，提高弱抗原的免疫原性、抗原与HLA之间的结合自由能及CTL活化水平[29]。

3.2 抗原残基结构的修饰

较小的多肽具有化学合成优势，但易受内源性蛋白酶的快速降解。系列研究发现，引入足够数量和分布的α螺旋骨架修饰来阻碍蛋白酶作用，可解决小分子肽易被降解的不足[30-31]。糖尿病研究发现天然表位翻译后修饰（包括瓜氨酸化、氯化、脱酰胺和氧化）后，44%胰岛素-B衍生肽与HLA-A * 02：01的结合能力增强，产生与HLA结合亲和力更强的肽，增强T细胞识别和活化[32]。肿瘤新抗原肽是否有此类修饰效应，尚需实验予以证实。

3.3 抗原多肽偶联胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（cytidinephosphate-guanosine，CpG）

免疫佐剂可部分解决新抗原肽弱免疫原性的问题。其中，胞嘧啶-硫代磷酸盐-鸟嘌呤寡聚脱氧核苷酸（CpG oligonucleotide，CpG ODN）因具有低毒、高效等特点而成为近年来常用的免疫佐剂，其包含未甲基化的CpG二核苷酸序列，类似于细菌DNA中常见的序列，可特异性触发Toll样受体9，有效触发树突状细胞的活化和成熟，使其分泌大量细胞因子、趋化因子和干扰素，有助于增强抗原的呈递，并诱导极化辅助性T细胞1型免疫应答，见图3。研究表明抗原肽和CpG ODN须在同一抗原提呈细胞中共定位，如将抗原肽与CpG以共价偶联、物理吸附、纳米载体包裹等多种方式形成新型多肽疫苗，使疫苗进入同一抗原提呈细胞内并同步释放，以产生最有效的抗原特异性免疫应答[33]。

图3 新型多肽疫苗活化CD8+T细胞

4 小结与展望

综合国内外对新抗原筛选与免疫原性改进的相关研究发现，新抗原的大规模临床推进与应用仍需深入研究，从而简化筛选流程、鉴定高效肿瘤新抗原。目前，新抗原免疫原性的改造仍聚焦于提高TCR-HLA-peptide三者复合物的亲和力与稳定性，积极研究并探索其他可能影响免疫效应的因素，并基于体内外实验及临床研究的结果，对其安全性和有效性进行评估。