无机纳米材料用于糖尿病创口愈合的研究进展

郑忠芹,孟 杰

(1.成都市新都区人民医院内分泌科,四川 成都 610500;2.成都市新都区第二人民医院急诊科,四川 成都 610501)

糖尿病(Diabetic Mellitus,DM)是由于胰岛素分泌绝对、相对不足或胰岛素在靶细胞中不能发挥正常生理功能,导致以葡萄糖代谢异常为特征的慢性疾病[1].世界卫生组织(World Health Organization,WHO)将糖尿病分为四类:Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、特异性糖尿病和妊娠期糖尿病.其中,Ⅱ型糖尿病约占糖尿病患者总数的90%以上[2].根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)数据显示2021年全球糖尿病的患者高达5.37亿,估计到2045年将上升至7.83亿[3].与糖尿病本身相比,由糖代谢障碍引发的并发症才是导致患者死亡的最直接原因,如视网膜脱落病变、糖尿病肾病以及糖尿病创口等.在慢性创面中足溃疡是最常见也是最严重的慢性疾病.

糖尿病足溃疡(Diabetic Foot Ulcer,DFU)给患者造成了严重的健康和经济负担.在中国,DFU患者年新发溃疡发病率为31.6%,截肢率为5.1%,1年内年死亡率14.4%[4].在美国,有19 %～34%的糖尿病患者受到足溃疡的影响,保守估计每年有59亿美元用于创口愈合方面且治愈成功后1年内复发率约达40%[5].目前研究普遍认为,糖尿病患者皮肤中感觉神经病发生异常病变,使基本的“感觉”和“疼痛”减少甚至丧失,引发神经系统对伤口不敏感,进而大大增加了足溃疡甚至截肢的风险[6].高血糖可引起血红蛋白糖基化,同时伴随血管变窄、红细胞膜改变,导致伤口组织供氧不足,引起血管病变.血管病变也可能导致或加剧患者“感觉”的丧失[7].在此基础上,细菌感染和生物膜的形成进一步恶化伤口微环境.简而言之,由高血糖引起的氧化应激,促使组织中促炎因子表达,引起糖尿病性神经病变和血管病变,进一步的细菌感染恶化了糖尿病患者创口,导致创面久不愈合(图1).

图1 糖尿病创口久不愈合的因素[8]Fig.1 Factors for prolonged non-healing of diabetic wounds[8]

目前对糖尿病创口的治疗手段包括局部清创;伤口敷料;负压治疗;干细胞移植以及生长因子治疗等策略[9].但是传统疗法在临床上存在一定的应用缺陷,反复的手术清创给患者带来极大的痛苦;传统敷料作用效果不明显,而且频繁地更换敷料有加重感染,甚至有致敏风险;干细胞移植和生长因子治疗目前还存在靶向性差,半衰期短等问题[10].因此,患者亟需一种便宜简单的治疗手段.

随着纳米技术的快速发展,无机纳米材料作为一种全新的治疗手段登上生物医学应用的舞台.无机纳米材料相较于有机纳米材料,(1)其本身具有类似于类超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、类过氧化氢酶(Catalase,CAT)、类过氧化物酶(Peroxidase,POD)以及类氧化酶(Oxidase,OD)等氧化还原模拟酶活性.因此,其可以在机体内调节活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平,上调ROS可用于抑制细菌等病原体的增殖,防控感染源[11],而下调的ROS可以缓解氧化应激程度[12];(2)其比表面积大、表面活化位点多,可以充分实现其多种类酶级联催化,极大提高催化效率;(3)与有机材料不同在于,无机纳米材料自身结构稳定性强,可作为模拟酶在高温、不同pH等极端条件下也易维持催化活性;(4)更重要的是,与天然酶不同,使用无机纳米材料,可以避免被蛋白质变性或被蛋白酶消化等情况.

通过操纵无机纳米材料的尺寸、形态和比表面积,调控其物理化学性质,改善与生物分子的相互作用,增强药物在特定位置的靶向内化,实现纳米材料的可持续释放药物,以及降低与机体的不兼容性和不良反应以提高治疗效果.因此,本文基于无机纳米材料结合糖尿病创面愈合的四步病理生理过程,阐述慢性炎症伤口的愈合机制,总结其在生物医学应用中现有的问题并展望未来的发展方向.

1 创口愈合的生理病理学过程

皮肤作为人体最外层保护器官,保护内部器官免受外界环境的直接影响.当皮肤受损后,其保护功能迅速丧失,创口部位的愈合系统被激活.创口的愈合是一个恢复组织完整性的复杂生理、病理学过程.普遍认为由四个紧密联系阶段构成:止血期、炎症期、肉芽组织形成期和组织重塑期[5].同时按照创口恢复的时间快慢可分为急性与慢性.一般认为,糖尿病创口属于慢性伤口,在其愈合的某一阶段因阻滞而导致结构畸形,阻碍了合理有序的愈合过程[13].

1.1 正常创口愈合过程

止血期:皮肤组织受损后,局部血管迅速收缩,血小板与胶原蛋白结合发生聚集并黏附于受损的血管上,凝血酶激活纤维蛋白网状物结构形成与凝血因子渗出液发生凝血级联反应,止血并暂时保护受伤的区域[14].

炎症期:嗜中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞被募集到伤口清除伤口异物、受损的内源性组织、凋亡细胞、细菌的蛋白酶、生长因子等,同时吸引其他免疫细胞到创口处进行组织修复;其释放ROS、趋化因子和血管活化因子以及其他介质使创口进入炎症阶段.在此阶段伴随血管的通透性增加,液体积聚,创口部位易发生肿胀疼痛[15].

肉芽组织形成期:在此阶段,其核心在于填充和覆盖旧的伤口.首先,成纤维细胞、角质细胞以及内表皮细胞在接收到巨噬细胞等细胞因子以及生长因子信息后,在伤口表面分泌胶原蛋白,开始产生形状类似肉芽的肉芽组织、新生血管生成.紧接着,伤口边缘收缩并拉向伤口中心.最后,伤口周围的基底细胞继续增殖和迁移,到达伤口表面后形成上皮细胞[15].

组织重塑期:肉芽组织中的胶原蛋白III逐渐被胶原蛋白I取代,并且细胞外基质(ExtraCellularMatrix,ECM)发生重排,新生组织的强度增加.毛细血管网络退化、数量减少,毛发、汗腺以及皮脂腺再生,伤口愈合[5](图2).

图2 正常创面愈合的过程[16]Fig.2 The process of normal wound healing[16]

1.2 糖尿病创口愈合的过程

糖尿病创口是作为典型慢性创口,其糖尿病微环境阻碍了创面愈合的级联进程.(1)过度氧化应激.在长期高血糖微环境刺激下,机体产生过量的ROS.ROS与晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)的联合作用,破坏蛋白多糖,抑制患者创口处血管内皮细胞的生成.其次,ROS也会促进基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)的表达,抑制细胞外基质的重构[17].(2)过度炎症.高糖微环境会抑制巨噬细胞的免疫和吞噬功能,导致细菌等异物清除不充分,机体炎症信号传递异常,进一步刺激机体上调促炎因子,促进巨噬细胞向M1极化,而M1型巨噬细胞的存在又会进一步分泌促炎因子,导致进入氧化应激无限循环,加剧机体的炎症级联作用[18].此外,持续的氧化应激会使中性粒细胞释放过量的蛋白酶,过量的蛋白酶会破坏ECM,延缓创口的愈合[19].(3)血管病变.糖尿病患者的糖代谢异常会诱导血管生成因子与血管抑制因子处于不平衡的状态,导致新生血管生成受损,血管功能障碍,运输营养物质及代谢产物受限,出现微循环缺陷,引起缺氧、缺血、毛细血管大小的下降、基底膜的硬化和小动脉缺陷等问题[15].此外,还存在发生内皮细胞功能障碍,降低包括一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,iNOS)在内的基本生理活性.(4)外界感染.细菌等会在创口处通过筋膜、肌腱和肌肉等感染,由于高糖微环境,给病原体提供生长的温床加快了其组织感染的进展,甚至会诱发更严重的败血症、截肢等问题[20].

2 无机纳米材料在糖尿病创口愈合中的应用

由于无机纳米材料具有独特的拟酶特性,其中贵金属、金属及金属氧化物、碳基纳米材料等大量应用于抗氧化应激、抗炎、促血管生成以及抗菌方面,有效促进糖尿病创口的愈合.

2.1 抗氧化应激

研究表明,在炎症期,创口处少量的ROS在其愈合进程中发挥着重要作用.但是,高血糖微环境会造成创口部位产生过量的ROS,造成创口部位氧化应激,破坏蛋白多糖、DNA等活性物质、脂质过氧化和AGEs累积等,持续激活炎症并延缓伤口的愈合.因此,要设计一种合理的材料来调控血糖的水平同时清除过度的ROS,加速伤口修复.金纳米材料以其良好的生物兼容性和抗氧化特性,被广泛的应用到抗氧化的疾病中.Gurunathan[21]课题组利用金纳米颗粒(AuNPs)的SOD、CAT等抗氧化酶活性,成功抑制糖尿病小鼠脂质过氧化和ROS的生成.除了将通过清除ROS降低氧化应激水平外,消耗体内过剩的葡萄糖也不失为良策.Zhu[22]等人设计了富含缺陷的二硫化钼作为异质结构纳米片载体,其上负载牛血清白蛋白修饰的金纳米颗粒成功构建MoS2@Au@BSA NSs.Au潜在的葡萄糖氧化酶活性将高水平的葡萄糖转变为葡萄糖酸,缓解高糖微环境,降低氧化应激.在此基础上,Gu[23]等人通过构建Au-Cu2MoS4纳米片(Au-CMS NSs),成功将具有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶双酶活性应用于糖尿病创口愈合,原位将过量的葡萄糖消耗的同时将ROS转变为O2,克服糖尿病足溃疡高糖、乏氧的微环境,显著降低血糖和ROS的含量,成功实现了降血糖+清除ROS效果.Du[24]等人针对糖尿病患者创口处超氧化物歧化酶水平偏低,机体处于过度氧化应激状态,进而导致细胞损伤,阻碍创口处干细胞增殖和分化不良,抑制伤口愈合的思路,设计将CeO2原位修饰到负载环丙沙星的聚合物囊泡表面构建CIP-Ceria-PVs.囊泡上致密的聚合物链可防止CeO2在生成过程中被氧化和聚集,从而使得CeO2纳米颗粒有更大的比表面积、更高比例的氧化还原电子对(Ce3+/Ce4+),最终表现出优异的SOD活性,有效地去除ROS降低氧化应激水平.Ren[25]等人利用Cu/Zn纳米材料的超氧化物歧化酶,通过外源性补充SOD活性有效清除创口处氧自由基.Cheng[26]等人成功开发一种非晶态Ru@CoSe纳米层.利用Ru原子丰富的电子和空轨道作为“调节器”来调整Co位点的电子状态,并有效改善活性位点,表现出超强的过氧化氢酶活性(最大反应速度可达23.05 μm s-1、周转率为2.00 s-1),体内实验揭示Ru@CoSe在炎性糖尿病伤口上显示出较好的ROS消除能力.Chi[27]等人将丝纤维素和羧甲基纤维素里面封装MnO2制造的双网水凝胶SF/CMC@MnO2.这种双网络复合水凝胶不仅通过在原位将过多的ROS转化为所需的O2来缩短糖尿病患者的炎症期,还能下调MMPs的表达,促进基质重塑,加快创口的愈合(图3).

图3 Ru@CoSe在炎性糖尿病伤口中的运用[26]Fig.3 Ru@CoSe in inflammatory diabetic wounds[26]

2.2 抗炎

适度的炎症有利于创口的愈合,但是糖尿病患者由于存在脂代谢和糖代谢等异常,对生长因子的反应受损,血液循环不良,会诱导创口过度释放促炎细胞因子,产生活性氧和其他微血管并发症,激活免疫细胞的浸润;糖尿病微环境又会降低巨噬细胞的吞噬能力和活性,机体为了弥补损失,进而导致炎症介质长时间维持在较高水平,两者的共同作用使得其创面常常表现为持续性的过度炎症.合理的调控促炎因子和抑炎因子可以减少创口的过度炎症.发挥纳米材料本身的特性,打破炎症循环,是治疗糖尿病创口的良策.锌作为人体必需的微量元素,在伤口愈合过程有着重要的调控作用,能促进血管形成、上皮再形成等.Mo[28]等人鉴于ZnO在糖尿病创口中的作用,将ZnO纳米颗粒和牛至精油负载的多功能复合NF膜.通过下调促炎细胞因子IL-6和MMP-9成功终止炎症循环,促进了胶原蛋白沉积与上皮组织的修复,血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)的表达,减少伤口炎症,有效治疗糖尿病创面伤口.Kaur[29]等人将胰岛素与银纳米离子结合构建IAgNPs,通过调节抑制促炎症因子(IL-6、TNFα)和抑炎因子(IL-10)之间的关系来促进糖尿病创面重塑.Gao[30]等人通过将亲水性聚(PEGMA-co-GMA-co-AAm)(PPGA)聚合物与超支化聚-L-赖氨酸(HBPL)修饰的二氧化锰纳米酶交联,设计并制备了一种多功能水凝胶.水凝胶显著降低ROS程度,明显缓解了创口处IL-1β、IL-6、TNF-α和CXCL-1等炎症因子的水平明显降低,IL-4和IL-10等抗炎细胞因子的水平升高,同时伴随着中性粒细胞浸润的减少.如何将糖尿病患者从炎症期向肉芽组织形成期转化,有效的促进创口的愈合,其中巨噬细胞起到关键的调节作用.Lv[31]等人研发针对巨噬细胞免疫调控,及时阻止创面组织持续性的炎症环境,利用魔芋葡甘聚糖(KGM)修饰SiO2纳米材料构建KSiNPs.KSiNPs可通过在巨噬细胞表面甘露糖受体聚集来诱导M2型巨噬细胞的形成,产生的细胞因子能够诱导成纤维细胞增殖并随后分泌细胞外基质,促进糖尿病皮肤伤口的皮肤愈合.用KSiNPs处理后的伤口愈合效果和胶原蛋白产量显著提升,同时炎症因子水平下调,肉芽组织的血管新生增加.

2.3 促血管生成

糖尿病患者新生血管障碍主要源于巨噬细胞M2表达的血管内皮生长因子和HIF-1α通路障碍.另一个原因成纤维肌细胞迁移转化和血管内前列腺素的产生分泌降低导致iNOS表达降低,一氧化氮含量降低.此外,还有血管生成还受到其他信号的调节,例如氧气等.Wang[32]等人通过聚多巴胺(PDA)被涂覆在PBNPs表面,形成PB@PDA NPs.然后原位还原在PDA表面生成AgNPs,构建PB@PDA@Ag.通过减轻局部炎症反应和诱导创面VEGF表达来促进耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的糖尿病创面愈合,在治疗后第12天材料组的创面几乎完全愈合.Pan[33]等人将硼硅酸盐与蚕丝蛋白结合构建复合水凝胶,通过掺杂Cu2+稳定HIF-1α,并改善其与HRE序列和辅因子p300的结合,从而提高HIF-1α的转录活性,增强血管生成.在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠伤口修复显示SF-MA-BS明显加速了糖尿病创面愈合.Ma[34]等人将表面粗糙、内部含有L-精氨酸的中空CeO2纳米颗粒(AhCeO2NPs)用于肉芽组织形成期促进新生血管的生长.AhCeO2NPs粗糙的表面可以作为一个创面纳米桥,黏合创面边缘快速止血,AhCeO2NPs的酶模拟特性可以缓解创面氧化损伤,释放的L-精氨酸,诱导iNOS表达产生NO,促进血管的生成.Zhang[35]等人ε-聚赖氨酸涂覆的MnO2纳米片与胰岛素的自组装构建FCHO胶束.MnO2纳米酶通过将内源性的H2O2分解为O2,从而重塑了氧化伤口微环境,减少了炎症反应,刺激了血管生成,加速了细胞增殖,促进了肉芽组织的形成和ECM沉积.

2.4 抗菌

病原体的感染会在伤口中迅速发生,并诱发蜂窝织炎、骨髓炎和脓肿等疾病,是诱发糖尿病创口久不愈合的最直接原因,及时有效的控制感染是管理糖尿病创口最重要的手段.Ag纳米材料对各种细菌、病毒和真菌的广谱抗菌特性,已成为应用最广泛的抗菌纳米材料.但是,Ag NPs在高浓度下表现出严重的细胞毒性问题;同时,Ag NPs又极易团聚,显著降低其抗菌效果,从而阻碍其在实际的应用.为了解决这些问题,构建具有良好分散能力的抗菌复合材料成为主流.Wang[32]等人利用PB@PDA@Ag对甲氧西林金黄色葡萄球菌和AmprE抑制率分别约99.77%和99.99 %.Sun[36]等人利用 Ag+作为底物,络合Fe(Ⅲ)构建热敏水凝胶,在体外抑菌实验中对致病菌金黄色葡萄球菌抑制率接近100 %.在抑菌效果中,Au以独特的光热效果独具特色.Ren[37]等人通过原位生长法构建了金纳米团簇修饰锆基卟啉金属有机框架,构建Au NCs@ PCN纳米材料.在近红外激光照射下,AuNCs@PCN可以被加热到56.2 ℃并产生ROS,显示出对细菌的有效杀伤作用.Au通过破坏细菌生物膜结构和诱导蛋白渗漏,在对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率分别高达 95.3% 和 90.6%.Au NCs@PCN治疗的糖尿病大鼠在21天内伤口覆盖率降低到2.7%.除了像Au这样的贵金属有良好的光热效应外,一些非金属材料也在光热抑菌方面也独具魅力.金属基纳米材料主要通过诱导氧化应激和破坏生物膜结构来杀死细菌.然而,它们在水中的稳定性和释放的金属离子引起的毒性仍存在很大的不确定性.另一方面,碳基纳米材料特别是碳点(CDs)凭借其选择性电子转移和光捕获能力已成为无金属催化剂中的佼佼者.Huang等人以三油酸脂为原料,通过简单的热解反应制备了可编程碳点脂质体(CDsomes).在紫外光(385 nm)和绿光(532 nm)照射下,CDsomes 可以实现“ON”和“OFF”的状态.处于“ON”态的CDsomes参与一个与热力学有关的光催化反应,产生过氧化氢,处于“OFF”态的CDsomes通过过氧化酶模拟活性产生羟基自由基.CDsomes在紫外光照射下被预先激活,以避免在原位绿光照射后直接对组织产生有害影响.由于自我保存油酸的内在特性,这促进了炎症免疫反应的快速愈合.评估CDsomes对感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的糖尿病小鼠的伤口愈合效果,在第六天创口大小与正常小鼠创口大小无明显区别,12天后创面愈合.碳基材料优异的光热性能在光热疗法的抑菌效果引人注目,为了进一步增强碳点纳米材料的抑菌的能力.Liu[38]等人将铁掺杂与CD从而增强了其过氧化物酶活性.利用光热疗法和产生ROS以杀死细菌,促进成纤维细胞增殖、血管生成和胶原沉积,显著提高了伤口愈合效率.Fe-CDs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌率分别为99.68%和99.85%,光热转换效率达35.11%.除了应用广泛的贵金属材料、碳基材料外,CuO[39]、ZnO[40]、CeO2[41]纳米材料也被有效运用于抑菌,促进血管形成,在相应的动物模型中也展现出优异的治疗效果.

3 总结与展望

由糖尿病介导的慢性创口愈合本身生理机制复杂,又加上体内炎症的恶性循环和体外细菌感染的交叉影响,多种效应下使得糖尿病创口的恢复变得极具挑战性.本文从糖尿病创口和组织愈合的特点入手,基于无机纳米材料的抗氧化应激、抗炎、促血管生成以及抗菌四个特性,总结不同纳米材料在伤口愈合方面有各自的优缺点,探讨纳米材料在糖尿病创口愈合潜在的机制.在未来,如何更好地把握糖尿病伤口的生物学特点,利用各种技术制备多功能的纳米体系,开发多种治疗手段,以期实现1+1>2的目标,提高创口愈合率.除了基于在实验室利用动物模型外,进一步探索如何将所研究的纳米材料应用于临床,需要进行更深入的分析材料的理化性质、生物兼容性和体内分布等安全问题.此外,除了注重于治疗的效果外,本着以人为本的思想,我们还要关注患者对治疗过程的感受,也是未来实现临床落地需要考虑的内容.