快速滤过型净化结合超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中氟虫腈及其代谢物残留量

杜 鑫，何家国，易珊珊，陈绍辉

(南充农产品质量监测检验中心，四川 南充 637000)

茶叶中富含氨基酸、茶多酚、黄酮、茶多糖等营养物质，具有抗氧化、助消化、抗疲劳、抗癌和抗炎的作用，有助于降低患高胆固醇和心血管疾病的风险，对人体健康有很大益处[1-2]。茶树适宜生长在地势高、湿度大的地区，茶叶在生长过程中易出现病虫害。氟虫腈是一种苯基吡唑类杀虫剂，对害虫以胃毒作用为主，兼有触杀和一定的内吸作用，其作用机制在于阻碍昆虫γ-氨基丁酸控制的氯化物代谢，造成其神经功能受损，从而引起死亡，对作物无药害，被广泛用于蔬菜、水果、茶叶等农产品领域[3-5]。但是，大量研究表明其有神经毒性作用，长期摄入可能导致肝肾损伤[4-5]。在现行的食品安全国家标准中[17]，氟虫腈残留物为氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜之和，以氟虫腈表示，但尚未规定茶叶中氟虫腈的最大残留限量。

茶叶中含有大量的色素、嘌呤生物碱和茶多酚等物质，基质复杂，而茶叶农药残留的含量较低，严重影响检测[15-16]。良好的净化前处理方法不仅消除大部分基质干扰，还可以延长分析仪器使用寿命。QuEChERS方法具有操作简易、溶剂用量少、分析速度快等优点，被广泛应用于各类样品的前处理过程[6-9]。快速滤过型净化法(multi-plug filtration cleanup，m-PFC)是一种结合固相萃取净化原理和QuEChERS方法新开发的一种新型快速样品前处理净化技术[10-16]。该技术通过筛板将复合型多壁碳纳米管(MWCNTs)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和十八烷基硅烷键合硅胶(C18)等固相材料固定于注射器中，通过单次或反复推拉注射器活塞，使提取液中的色素、有机酸、脂肪、糖类等杂质与填料层作用，但目标物不被吸附，从而实现萃取净化一步完成，从而大大缩短净化时间，净化速度快，前处理效率高，已用于鸡蛋[10]、海产品[11]、大豆[12]、果蔬[13]、人参[14]、茶叶[15-16]等多种农药残留检测前处理。本研究将m-PFC净化方法与UPLC-MS/MS技术相结合，建立了同时快速检测茶叶中氟虫腈及其代谢物残留量检测方法，优化了测定条件，实现了简便、快速、准确检测大批量茶叶样品。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂 Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S超高效液相色谱—串联质谱仪，ML802型分析天平，GD16plus高速研磨均质仪，3-18KS型高速冷冻离心机，Vortex Genius 3型旋涡混合器，Milli-Q型超纯水仪，50 mL离心管，PTFE (0.22 μm)针筒式微孔滤膜。

氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈硫醚等标准品浓度均为1 000 mg/L。甲醇、乙腈、浓氨水、甲酸均为质谱级，乙酸为优级纯。QuEChERS盐包(含 4g MgSO4，1g NaCl，1.5 g柠檬酸钠)、QuEChERS试剂盒、陶瓷均质子(2 cm×1 cm)。KNORTH m-PFC C-5(深色基质)净化柱(5 mL/800 mg，300 mg MgSO4，130 mg C18，250 mg PSA，120 mg MWCNTs，货号ZC69022-C5)。

1.2 样品制备 茶叶(绿茶、白茶、红茶、黑茶等)样品均购买于某地茶叶加工厂和市场销售门市。取代表性的茶叶样品500 g放入粉碎机中粉碎，样品全部过425 μm的标准网筛，混匀后装入装入洁净的聚乙烯塑料样品袋中，密封并注明标记，将试样放于-18℃冷冻保存.

1.3 样品提取 准确称取2 g(精确到0.01 g)粉碎后的茶叶样品于50 mL离心管中，加入10 mL水涡旋混匀后静置浸泡10 min，依次加入1颗陶瓷均质子、1袋QuEChERS盐包和10.00 mL 乙酸+乙腈溶液(1+99，V/V)，拧紧离心管盖，放入低温(5℃)高速研磨均质仪中3 000 r/min均质提取4 min，然后5 000 r/min离心3 min，收集上清液待净化。

1.4 样品净化 QuEChERS方法：吸取5 mL上清液加到内含1 200 mg MgSO4+400 mg PSA+400 mg GCB的15 mL塑料离心管中，涡旋混匀2 min，5 000 r/min离心3 min，吸取2 mL上清液过0.22 μm滤膜，待上机测定。

m-PFC净化法：在净化柱前端串联装上2个0.22 μm有机微孔滤膜，置于进样瓶上方，移取2 mL上清液于m-PFC净化柱中，缓慢推动注射杆，控制液滴速度1滴/s，混匀后即得待测液，用UPLC-MS/MS分析，实验流程(图1)。

图1 样品前处理流程图

1.5 仪器检测条件

1.5.1 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱(100 mm×3.0 mm，3.5 μm)，柱温40℃，样品室温度18℃，进样体积1.0 μL；流动相为含有体积分数为0.05%甲酸的甲醇(A)、体积分数为0.1%氨水的水溶液(B)及乙腈(C)组成的混合溶液，并按(表1)中的梯度洗脱程序分离目标物。

表1 UPLC流动相组成和梯度洗脱程序

1.5.2 质谱条件 用电喷雾离子源，毛细管电压为3.0 kV，锥孔气和脱溶剂气都用高纯氮气，锥孔气流量为150 L/h，脱溶剂气温度为500℃，其流量为1 000 L/h，碰撞气为高纯氩气，其流量为0.10 mL/min。采用电喷雾负离子模式(ESI-)和选择多反应监测(MRM)方式采集数据，质谱仪信号采集时间段为3.5～7.6 min，利用在线切换阀将其他时间段的液相色谱流动相切换到废液，从而减小仪器污染，延长仪器使用寿命。

1.6 标准溶液的配制 分别准确吸取4种待测物的标准溶液各1.00 mL 置于10.0 mL 容量瓶中，乙腈稀释配制成 100 mg/L标准溶液。用乙腈逐级稀释配制成10、1 mg/L混合标准储备液，于4℃冰箱冷藏避光保存。称取筛选出的空白茶叶样品按前处理方法制成基质溶液，按比例准确加入一定体积的农药标准储备液，配制成不同浓度的基质标准工作液，现用现配。

2 结果与分析

2.1 液相色谱-质谱条件优化 在ESI-模式下，选取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)为流动相。样品提取液为酸化乙腈，选择在水相中加入少量氨水来改善目标物的峰形拖尾，并提高4种农药的电喷雾离子化效率。另外，在甲醇中加入少量甲酸后，形成了一个稳定的缓冲体系，有利于实样中目标物检测。为方便摸索优化条件，先用甲醇+水(50+50，V/V)配制了0.50 mg/L氟虫腈及其代谢物的标准溶液。

采取质谱直接进样的方式来优化质谱条件，在不同流动相体系对氟虫腈及其代谢物进行了全扫描，分析其响应信号强度，结合仪器“Intellistart”功能快速优化出的质谱检测参数(表2)。试验发现：由于氟虫腈及其代谢物在分子结构式上都有氨基，既可以得到一个质子形成[M+H]+，又可以失去一个质子形成[M-H]-。在电喷雾负离子模式下，氟虫腈及其代谢物基线响应更低，干扰更小，这是由于其结构中含有较多的卤代基和氨基，在电喷雾离子源内更易失去电子形成负离子。采用色谱进样，观察目标物的保留时间、峰形、响应信号强度，优化后的流动相梯度体系(表1)，氟虫腈及其代谢物的标准溶液色谱图(图2)。结果表明，4种农药在7 min内全部出峰，峰形及分离度很好，都有较强的分子离子峰强度。采用甲醇-乙腈-水体系并加入少量氨水和甲酸后，提高了目标物的离子化效率，有效改善了目标物峰形，增强了目标物响应信号，有利于提高方法选择性和灵敏度。

表2 氟虫腈及其代谢物在MRM模式下UPLC-MS/MS分析的质谱参数

图2 氟虫腈及其代谢物的试剂标准溶液MRM色谱图(5 μg/L)

2.2 提取剂优化 初步选取乙腈、甲醇、丙酮等有机溶剂作为提取剂，按添加50 μg/kg浓度水平进行样品加标回收试验，比较分析了3种溶剂的提取效率。试验发现：用丙酮和甲醇为提取剂时，浸提出的杂质较多，提取液比较浑浊，导致基质效应比较严重。乙腈具有极性大、穿透性强，通过盐析法除掉茶叶中的色素、蛋白质、糖分等大部分杂质，茶叶提取液颜色更加澄清，极大地减弱部分基质干扰。氟虫腈及其代谢产物为含有较多氨基的弱碱性化合物，其在酸性溶剂中的溶解度大于中性溶剂，进一步考察了乙酸+乙腈溶液(1+99，V/V)提取效率，发现其提取效果优于乙腈，故选用乙酸+乙腈溶液(1+99，V/V)溶液作为提取溶剂。另外，茶叶样品在用有机溶剂提取前加适量水使其充分润湿溶胀，可提高提取效率。

2.3 净化方式选择 在传统QuEChERS方法中，主要以PSA、C18、GCB等为净化吸附剂。PSA利用阴离子交换吸附蛋白质、糖类和极性较高的物质，C18主要用于吸附脂肪和脂类等非极性干扰物，GCB常作为弱极性或非极性吸附剂来除去色素和甾醇等疏水性化合物。试验用未经净化的绿茶、红茶、白茶和黑茶空白基质提取液直接配制了50 μg/L氟虫腈及其代谢物的混合基质溶液，接着用QuEChERS净化法和m-PFC柱净化法处理同一批空白基质提取液，用净化后的茶叶基质溶液配制50 μg/L标液作为对照，一起上机检测，比较分析了两种净化方法对氟虫腈及其代谢物的萃取净化效果和回收率，结果(图3)。

图3 QuEChERS和m-PFC净化法对目标物回收率的影响

选取绿茶、白茶、红茶、黑茶等基质，用QuEChERS和m-PFC法净化样品时，氟虫腈及其代谢物的回收率均>80%，且m-PFC法回收率均高于QuEChERS法。QuEChERS法降低了目标物回收率或是由于净化填料中的GCB对具有平面结构的农药具有很强的亲和力，吸附了少量的苯基吡唑类结构的氟虫腈及代谢物，导致回收率降低。据相关研究[10-16]，MWCNTs是一种纳米级中空材料，不仅结构独特且具有不同的电子、化学性能和高比表面积，表面键合不同的官能团或配合物，改善其溶解性和分散性，使其能够改善分散固相萃取对基质干扰化合物的去除效果，常用其替代GCB去除基质中天然色素、固醇类、生物碱等大分子干扰物，对茶叶中杂质如色素、有机酸、茶多酚等吸附容量更大，吸附能力更强，还能改善对具有苯并杂环类结构农药的吸附问题。

此外，QuEChERS净化包净化法移取上清液振摇净化后需要再次离心，m-PFC柱采用注射器式设计，净化过程不需旋涡振荡和离心，每一批次样品(16个)前处理时间可控制在20 min以内，比QuEChERS净化管操作更加简便。MWCNTs和PSA配合使用提高了净化效率，有效降低了基质中杂质的干扰，提高了目标物的回收率。综合净化效果和提取效率，后续试验选取m-PFC柱净化，茶叶空白基质及基质标准溶液色谱图(图4、5)，净化后的茶叶空白基质不干扰目标物的测定。

图4 绿茶空白基质MRM色谱图

图5 氟虫腈及其代谢物的基质标准溶液MRM色谱图 (50 μg/L)

2.4 基质效应的影响 基质效应(ME)是液质联用检测方法中普遍存在的现象，可能是色谱分离中的共流出物影响了待测目标物的离子化效率或样品基质影响了离子源电喷雾离子化效率，从而导致目标物响应信号的增强和减弱[6-8]。用基质空白和试剂空白分别配制50 μg/L标准溶液，采用色谱进样来获得目标物的定量离子色谱峰面积，重复测定3次。采用相对响应值法来计算4种目标物ME的相对强度(ME=农药在基质中的定量离子对峰面积/农药在试剂中的定量离子对峰面积)，考察了不同茶叶样品基质的影响，结果(图6)。选取的4种茶叶样品基质，氟虫腈的ME值为1.11～1.19，氟甲腈的ME值为0.82～0.94，氟虫腈硫醚的ME值为0.92～1.02，氟虫腈砜的ME值为0.92～0.99，氟虫腈有略微基质增强效应，其余3种代谢物有较小的基质减弱效应。

图6 氟虫腈及其代谢在4种茶叶基质中的ME

用反相高效液相色谱法分离目标化合物，减少了共流出物的基质干扰，还用基质匹配标准溶液校正方法对基质效应进行补偿。但是，在大批量茶叶样品检测过程中，茶叶样品种类众多，很难做到每一种茶叶检测均匹配基质标准溶液来绘制标准曲线。为此，对农药在白茶、红茶、黑茶基质中的ME与绿茶基质的ME做了对比分析，结果(图7)。4种农药的ME值均在0.95～1.14，说明不同茶叶品种间的基质效应差异并不明显，在筛选时可选择一种茶类的空白基质配制标准工作曲线进行定量分析。

图7 在白茶、红茶、黑茶的微乳剂/绿茶的ME

2.5 方法的线性范围和检出限 用绿茶空白基质配制4种农药的混合标液，以每种农药的质量浓度(x，μg/L)为横坐标，定量离子对的色谱峰面积(y)为纵坐标，进行线性拟合，结果(表3)。标准曲线线性相关系数r均>0.999，用Masslynx V4.1软件计算信噪比(S/N)，以S/N=3计算得到方法的检出限为1.2～1.8 μg/kg。

表3 多反应监测模式下氟虫腈及其代谢物的线性范围、线性相关系数和检出限

2.6 方法的回收率、精密度和定量限 称取2 g绿茶、红茶、白茶、黑茶于50 mL离心管中，分别添加5.00、10.0、500 μg/kg 3个浓度水平的农药，涡旋1 min，密封过夜，次日按照1.2～1.6节条件进行样品前处理及上机检测，每个浓度水平做3个平行质控样。以回收率表示准确度，以回收率的相对标准偏差(RSD)表示精密度，结果(表4)。氟虫腈及其代谢物在4种不同茶叶基质中的加标回收率为76.4%～104.1%，RSD为2.7%～6.4%，均满足农药残留检测的要求[18]，表明该方法准确度较高，精密度良好。经加标回收率试验验证，定量限均为5.0 μg/kg。

表4 氟虫腈及代谢物在茶叶样品的加标回收率和精密度(n=3)

2.7 实样检测 用该方法对某地茶叶加工厂和门市抽取的40个茶叶样品进行检测，每个样品做平行双样。均没有检出氟虫腈及其代谢物。

3 结论

试验将m-PFC柱净化法和UPLC-MS/MS技术结合用于快速检测茶叶中氟虫腈及其代谢物残留量，净化过程不需要旋涡振荡和离心，大幅提升检测效率，比传统QuEChERS净化管操作更加快捷高效。该方法具有操作简便、灵敏度高、准确度和精密度良好等优点，适用于大批量茶叶中氟虫腈及其代谢物的快速定量检测，也可为制定氟虫腈在茶叶中的限量值提供参考。