高效液相色谱-串联质谱法检测柑橘中4种新烟碱类农药的残留量

赵 飞，张 武，张毓秀，刘婷婷，韩明月，吴玉凡，李 艳

(天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心，天津 300193)

柑橘因富含大量糖分、维生素、及矿物质等营养物质成为深受我国国民喜爱的水果之一。新烟碱类农药作为第四代杀虫剂，具有高效、广谱及良好的根部内吸性、触杀和胃毒作用等特点[1]，其中吡虫啉、啶虫脒、噻虫胺、噻虫嗪等杀虫剂常在柑橘种植过程中使用。此类农药具有沸点高，热稳定性差，分子量大的特点，不适合采用气相色谱仪(GC)，气相色谱串联质谱仪(GC-MS)对其残留进行检测[2]，高效液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS)结合了液相色谱的高分离能力以及质谱的分析范围广、灵敏度高的特点，适用于新烟碱类农药的分析。目前关于柑橘中同时检测这四种新烟碱类农药的研究相对较少且之前的相关研究所采用得前处理方式大多是固相萃取法，这类方法需大量有机试剂及诸多前处理仪器，成本较高且过程复杂、耗时长[3-5]。本文采用提取液经N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基键合硅胶(C18)等材料净化，上清液直接上机检测的方法，使用LC-MS/MS对柑橘中吡虫啉、啶虫脒、噻虫胺、噻虫嗪四种新烟碱类农药残留进行检测，并对提取液及净化材料进行了优化。旨在节约前处理成本，缩短检测时间，提高检测效率，降低基质的干扰性，提升检测的准确度。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂 实验仪器：Thermo TSQ Quantum Access 三重四级杆串联液质联用仪；JJ200电子天平；BP211D 电子微量天平；3K-15高速离心机。

实验试剂、耗材及标准品：乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，甲酸(分析纯)，氯化钠(NaCl)，无水硫酸镁(MgSO4)，无水醋酸钠，乙酸铵，PSA，C18(以上固体试剂均为分析纯)。滤膜：0.2 μm，有机过滤膜。吡虫啉、啶虫脒、噻虫胺、噻虫嗪标准溶液，溶度均为1 000 mg/L。

1.2 标准溶液的配置 准确吸取吡虫啉、啶虫脒、噻虫胺、噻虫嗪单个农药标准溶液1 mL，用甲醇做溶剂，定容至10 mL，配制成100 mg/L浓度的单标溶液。各取1 mL单标溶液，用甲醇做溶剂，定容至10 mL，配制成10 mg/L混合标准储备溶液。使用柑橘空白基质提取液将10 mg/L混合标准储备溶液稀释为5、10、20、50、80、100、200 μg/L。

1.3 样品前处理 提取 称取10 g(精确至0.01 g)已匀浆的柑橘样品于50 mL塑料离心管中，加入10 mL 0.5%甲酸-乙腈封闭浸泡1 min，随后剧烈振荡l min，加入2 g氯化钠、1 g无水醋酸钠，剧烈振荡l min后5 000 r/min离心5 min。

净化 定量吸取4 mL上清液至装有PSA，C18，MgSO4等净化材料的15 mL塑料离心管中，剧烈振荡l min，冰浴5 min后涡旋30 s混匀。5 000 r/min离心5 min，吸取1 mL上清液过0.2 μm微孔滤膜，待测定。

1.4仪器条件

1.4.1 液相色谱条件 色谱柱：HyperisilGold，2.1 mm ×l00 mm，粒径5 μm；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；色谱柱温度：25 ℃；流动相：A相为5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)溶液，B相为甲醇溶液，流动相梯度(表1)。

表1 流动相及其梯度条件(VA + VB)

1.4.2 质谱条件 电离方式：电喷雾电离(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测 (MRM)；离子源参数参考条件：毛细管电压：5 500 V，离子传输毛细管温度：350 ℃；雾化气：0.345 MPa；辅助加热气：0.345 MP4种农药质谱参数(表2)。

表2 4种农药的质谱参数

2 检测结果

2.1 标准曲线的建立 本研究采用外标法定量，将配制好的5～120 μg/L之间7个浓度点的空白基质混合标准溶液在1.4.1的液相色谱条件及1.4.2的质谱条件下上机检测，以溶液浓度 (x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标做标准曲线，4种农药的空白基质图谱(图1)，空白基质标准溶液图谱(图2)，空白基质标准曲线(图3)，回归方程及相关系数(表3)。结果表明，4种农药在范围内，质谱峰面积与农药浓度间呈良好的线性关系，相关系数(R2)均>0.999。

图1 4种农药的柑橘样品空白图谱

图2 4种农药的基质标准溶液图谱(50 μg/L)

图3 4种农药的基质标准曲线(5～200 μg/L)

表3 4种农药标准曲线的回归方程及相关系数

2.2 方法的回收率、精密度及灵敏度 在空白柑橘样品中分别添加5、10、20 μg/kg的3个水平的混合标准工作溶液，每个添加水平设6个平行样品，混合标准工作溶液添加后将样品封闭静置30 min，按照1.3的条件进行样品前处理，在1.4.1的液相色谱条件及1.4.2的质谱条件下上机检测，10 μg/kg添加水平下的加标样品图谱(图4)。计算4种农药在各加标水平下的平均回收率及相对标准偏差(RSD)，结果(表4)。4种农药在3个添加水平下的平均回收率在85%～93.5%，RSD<7.2%，符合农药残留检测的要求，检测效果良好。

图4 样品添加回收图谱(10 μg/kg)

表4 4种农药在各水平添加下的回收率及相对标准偏差(n=6)

2.3 实际样品检测 使用本研究的方法对购自不同市场的30个柑橘样品中这4种新烟碱类农药的残留进行检测，每个样品做双样检测。其中有2个样品有检出，检出的农药为啶虫脒和噻虫嗪，但是检出值均未超出该农药的最大允许残留限量[6]。

3 分析与讨论

3.1 基质效应的考察 基质效应(ME：Matrix Effect)指样品基质中的一种或多种非目标物组分对待测目标物浓度的检测准确度的影响[7]。本实验比较使用乙腈为溶剂的试剂标准曲线和使用空白柑橘基质提取液为溶剂的空白基质曲线，选取5～120 μg/L之间7个浓度点在1.4.1的液相色谱条件及1.4.2的质谱条件下上机检测，以溶液浓度 (x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标做标准曲线。基质效应可通过公式计算：ME(%)=空白基质标准曲线的斜率-试剂标准曲线的叙率)/试剂标准曲线的斜率×100。ME的绝对值大小代表基质效应的强弱，分为3个级别：|ME|<20%，是弱基质效应；20%<|ME|<50%，是中等强度基质效应；|ME|>50%，是强基质效应[8]。结果(表5)，4种农药的|ME|都在20%左右，表现为中弱强度基质效应，为了降低基质效应对检测结果的影响，本研究使用空白柑橘基质提取液为溶剂配制空白基质曲线。

表5 4种农药的基质效应

3.2 提取试剂的选择 分别使用乙腈、0.5% 甲酸-乙腈、乙酸乙酯作为提取剂对添加浓度为0.05 mg/kg的加标样品进行回收实验。实验过程中发现，乙酸乙酯作为提取剂时样品浑浊，共萃取物较多，回收率偏低，在70%～80%，这是因为新烟碱类农药极性较大，乙酸乙酯难以将其从含水基质中完全提出。乙睛的溶解性好，渗透力强，乙睛作为提取剂，回收率范围为75%～85%，考虑到提取剂通过适当的酸化，能促使更多农药从样品组织中溶出，使用0.5% 甲酸-乙腈与纯乙腈进行比较，酸化乙腈作为提取剂的回收率达到了80%～90%。经过对比，本研究选用0.5% 甲酸-乙腈作为提取剂。

3.3 净化材料的优化 柑橘中含有大量的糖类、维生素、纤维素、单萜等化合物类挥发油成分[9]，有效的去除基质中的糖类及挥发油成分是净化的关键环节。PSA可高效净化基质中的糖类及部分色素，C18可以净化基质中的脂类，MgSO4可有效吸附提取液中水分。为了优化净化效果，本研究选择了5种净化材料组合进行了对比：A：100 mg PSA+50 mg C18+900 mg MgSO4；B：150 mg PSA+900 mg MgSO4；C：150 mg PSA+50 mg C18+900 mg MgSO4；D：150 mg PSA+100 mg C18+900 mg MgSO4；E：200 mg PSA+100 mg C18+900 mg MgSO4，分别使用5种净化材料组合对添加浓度为20 μg/kg的加标样品进行回收实验，考察4种农药的回收率，结果(图5)，组合C和组合D都达到了良好的回收率，这表明150 mg PSA对糖类及部分色素的净化效果最佳，C18有效的净化了柑橘中的挥发油成分。从节约成本的角度考虑，选择组合C作为净化材料组合。实验过程中发现提取液中加入MgSO4会出现比较严重的放热现象，考虑到4种农药的热不稳定性，在加入净化材料震荡后，采用冰浴的方式降温来提高回收率。

图5 不同净化材料组合对4种农药回收率的影响

4 总结

本研究建立了高效液相色谱串联质谱测定柑橘中4种新烟碱类农药残留的分析方法，采用外标法定量，建立了空白基质标准曲线。在0.005～0.2 mg/kg范围内线性关系良好，加标回收率范围为85%～93.5%，相对标准偏差范围为5.2%～7.2%。定量限为0.005 mg/kg，满足国家对这4种农药在柑橘中最大残留限量的检测要求。本实验方法具有灵敏度高、操作简便、检测准确、精密度高等多个优点，适用于柑橘中吡虫啉、啶虫脒、噻虫胺、噻虫嗪4种新烟碱类农药残留的快速检测。