粮食中新兴真菌毒素的污染现状及毒理学研究进展

汪 爽, 赫 丹, 韩 君, 徐剑宏,史建荣, 祭 芳, 刘 馨, Lee Yin-Won

(江苏大学食品与生物工程学院1,镇江 212013)

(江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所;江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地;农业农村部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室;农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(南京)2,南京 210014)

(扬州大学园艺与植物保护学院3,扬州 225009)

(韩国首尔国立大学农业生物技术学院4,首尔 08826)

真菌毒素是产毒真菌侵染作物时产生的低分子量次级代谢产物,可造成多种食品和饲料产品污染[1]。液相色谱与质谱相结合的检测方法可以监测多种农产品中真菌毒素发生。本实验室长期监测我国粮食作物中真菌毒素污染发生,监测结果显示,粮食作物中发生较为广泛、污染程度较重的真菌毒素主要包括单端孢霉烯B族毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和赭曲霉毒素等。小麦、玉米等粮食作物中脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马毒素等污染严重[1]。近年来,随着真菌毒素研究的发展和检测技术的更新,一些新型真菌毒素不断被发现并在全球范围内频繁检出。目前将这些在农产品中污染较为普遍,尚未被列入常规风险筛查和监管、也尚无相关限量标准的真菌毒素种类,称为新兴毒素(Emerging toxins)[2]。新兴毒素和隐蔽型毒素(Modified toxins)的区别主要在于,后者更偏向于定义那些与基质结合或在寄主中、加工等过程中结构发生修饰的毒素种类[3]。针对主要污染的毒素种类,国内外已制定了限量标准[4]。粮食中新兴毒素检出率较高,污染分布也较为广泛,主要包括由镰刀菌(Fusariumspp.)产生的白僵菌素(Beauvericin, BEA)、恩镰孢菌素(Enniatins, ENNs)、串珠镰刀菌素(Moniliformin, MON)、镰刀酸(Fusaric acid,FA)等,以及由链格孢属(Alternariaspp.)产生的细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid, TeA)、链格孢酚(Alternariol, AOH)、交链孢酚甲基醚(Alternariol monomethyl ether, AME)、交链孢烯(Altenuene,ALT)等,见图1。国内外真菌毒素研究者应用多种模型评估了多种新兴毒素的毒理学效应。文章综述了粮食中新兴毒素污染现状和毒理学研究进展,以期为真菌毒素污染风险全面评估及防控技术研发提供参考。

图1 粮食中主要新兴真菌毒素的化学结构式

1 新兴镰刀菌毒素

1.1 白僵菌素(BEA)和恩镰孢菌素(ENNs)

BEA和ENNs是由多种镰刀菌侵染小麦、玉米作物后产生的环状肽类化合物(图1)。BEA因最早作为抗生素分离自白僵菌Beauveriabassiana而得名,主要由层出镰刀菌F.proliferatum、亚黏团镰刀菌F.subglutinans、轮枝镰刀菌F.verticillioides和尖孢镰刀菌F.oxysporum产生。ENNs由燕麦镰刀菌F.avenaceum、尖孢镰刀菌F.oxysporum、梨孢镰刀菌F.poae和三线镰刀菌F.tricinctum等合成[5]。

1.1.1 BEA和ENNs在粮食中的污染现状

BEA和ENNs污染在世界范围内广泛分布,在粮食及其制品污染程度较重(表1)。欧洲对新兴镰刀菌毒素的检测和报道相对较多,尤其在小麦、大麦、玉米及其制品中BEA和ENNs的污染较重,检出率高,污染程度较重的样品中,这几种毒素含量为每千克高达数十毫克[6-13]。相比而言,非洲和亚洲国家粮食中BEA和ENNs的相关污染报道较少,污染总体水平也较低[14-16]。我国BEA和ENNs污染主要出现在玉米、小麦粉和稻谷样品上,总体污染水平较低,但玉米样品中BEA检出率较高,可达1 mg/kg[17-20]。

表1 粮食中新兴真菌毒素的污染情况

1.1.2 BEA和ENNs的毒理学研究

已有报道的BEA和ENNs的毒理学数据汇总在表2。BEA作为一种离子载体,其形成的阳离子选择性孔洞破坏了离子生理浓度,影响细胞离子稳态[21]。BEA暴露导致细胞内Ca2+浓度增加,激活细胞色素C,导致半胱天冬酶3活性增强,诱导细胞凋亡和坏死[22]。BEA刺激活性氧产生、破坏线粒体和钾离子稳态、诱导细胞内脂质过氧化作用以及谷胱甘肽耗尽发挥细胞毒性[23]。BEA可诱导DNA损伤,造成细胞周期阻滞,BEA暴露导致染色体畸变,同源染色体交叉互换频率增加和微核形成,引起细胞凋亡[24]。BEA还会导致卵丘细胞中孕酮合成减少,受精卵中ATP损耗,早期胚胎中线粒体活性降低和功能异常[25,26],影响猪卵细胞和早期胚胎发育,危害生殖系统。此外,BEA还有免疫毒性,通过干扰树突状细胞迁移,增加白细胞介素-10分泌,影响适应性免疫反应的启动[27,28]。BEA在小鼠不同组织中分布情况不同,肝脏和脂肪组织中浓度最高[29],腹腔注射BEA并未对小鼠的体重、进食量和行为产生影响[30]。饲喂含BEA的饲料对肉鸡和火鸡的血生化参数及肉质无显著影响,对肉鸡和蛋鸡生长、饲料摄入和产蛋量影响也不显著[31]。ENNs的毒性作用机制与BEA相似[32,33],在不同细胞中,ENNs的毒性程度存在差异[24]。在Caco-2细胞中,ENNs暴露会引起DNA损伤,导致细胞周期停滞在G2/M期。毒代动力学研究发现,ENNB1在猪体内的绝对口服生物利用度较高,而在肉鸡体内吸收较差;相对猪而言,ENNB1在肉鸡体内的总清除率和分布体积都较高[34,35]。ENNs在不同物种间口服生物利用度和毒物代谢动力学参数差异可能与毒素在动物体内的生物转化效率有关。家禽和猪血浆中可检测到ENNB和ENNB1的羟基化、羧基化或羰基化代谢产物。ENNs或BEA暴露会诱导ABC转运蛋白编码基因表达上调,并诱导对化学药物交叉耐药性的产生[36]。此外,BEA和ENNs暴露破坏肠道屏障完整性,影响机体对外源性物质的生物利用度,造成动物更易感病且生产性能降低。肉鸡中ENNB、ENNB1和BEA主要残留在肌肉、肝脏和皮肤中,而ENNA和ENNA1仅在鸡肉中有微量检出[37]。

表2 新兴镰刀菌毒素的产生菌及其毒理学数据

1.2 串珠镰刀菌素(MON)

串珠镰刀菌素(Moniliformin,MON)是一种小分子水溶性化合物(图1),是一种酸性较强的有机酸,在自然界中通常以钠盐和钾盐的形式存在[2]。 MON主要由层出镰刀菌F.proliferatum、亚黏团镰刀菌F.subglutinans、燕麦镰刀菌F.avenaceum、藤仓镰刀菌F.fujikuroi和三线镰刀菌F.tricinctum等产生[38](表2)。

1.2.1 MON在粮食中的污染现状

全球范围内,小麦等谷物中MON检出较为频繁,饲料样品中污染相对更重[39-41](表1)。欧洲国家小麦、玉米样品中MON污染严重,意大利玉米样品MON检出率高达93.0%,最高质量分数2 600.00 μg/kg[7-9],非洲国家莱索托玉米样品中MON检出率达100%,最高质量分数1 200.00 μg/kg[15]。我国玉米主产区样品中MON的检出率也非常高,相比其他新兴镰刀菌毒素,MON的总体污染更重[17]。

1.2.2 MON的毒理学研究

MON通过抑制硫胺素焦磷酸依赖酶的活性、破坏三羧酸循环影响细胞能量供应,发挥毒性作用(表2)。MON影响丙酮酸和α-酮戊二酸氧化,抑制丙酮酸脱氢酶及其他以硫胺素为辅因子的多种酶活性[42]。体外研究表明,MON的细胞毒性具有细胞株特异性,体外半抑制质量浓度为24～100 μg/mL[43]。MON对人白细胞和血小板细胞增殖无显著影响,但对人体血红细胞有毒性[44]。MON通过干扰单核细胞分化成树突状细胞和巨噬细胞影响免疫系统,造成淋巴细胞裂解,并以剂量依赖性引起染色体畸变、同源染色单体交换增加[27]。MON具有较强的体内毒性,主要靶器官是心脏,会造成急性心力衰竭[45-47]。停药14 d后,处理组动物的中性粒细胞吞噬活性仍有所下降,表明MON对于免疫系统的抑制作用延续期较长[48]。此外,MON还具有植物毒性,引起玉米和小麦细胞坏死,影响生长调节和叶片卷曲等[49]。

1.3 镰刀酸(FA)

镰刀酸(Fusaric acid,FA)是β受体阻断药丁吡考胺的前体[50],主要由尖孢镰刀菌F.oxysporum、串珠镰刀菌F.moniliforme、层出镰刀菌F.proliferatum、亚黏团镰刀菌F.subglutinans、轮枝镰刀菌F.verticillioides和藤仓镰刀菌F.fujikuroi等产生[51](表2)。

1.3.1 FA在粮食中的污染现状

粮食中FA的污染报道较少(表1),但总体污染水平相对较重。加拿大和美国的干玉米、小麦及大麦样品中的检出率均超80.0%,每千克样品中最高可检出数十毫克FA,谷物为原料的猪饲料和高水分玉米样品FA检出浓度更高[52,53]。

1.3.2 FA的毒理学研究

FA的毒性主要包括细胞毒性和致畸性(表2)[54]。FA暴露对不同细胞系和癌细胞系均具有细胞毒性和生长抑制作用,FA(500 μmol/L)抑制WI-38成纤维细胞和大肠癌细胞增殖。在人肝癌细胞系(Hep-G2)中,FA可诱导氧化和线粒体应激反应,造成细胞凋亡及坏死[55,56]。FA暴露改变大鼠大脑和松果体神经递质[53],具有神经化学作用。通过铜螯合作用,FA可使脊索畸形,对斑马鱼具有致畸作用[57]。FA在病原菌侵染初期作为先导分子干扰线粒体功能,诱导植物细胞死亡[58]。

2 新兴链格孢毒素

链格孢毒素污染多种农作物,最常检出的种类包括链格孢酚(Alternariol, AOH)、链孢酚甲基醚(Alternariol monomethyl ether, AME)、细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid, TeA)、交链孢烯(Altenuene, ALT)、交链孢毒素(Altertoxins, ATXs)(图1)。A.alternata和A.arborescens可产生TeA、ALT、AOH和AME[59]。A.bertholletius、A.caelatus、A.nominus、A.pseudonominus、A.arachidicola和A.bombycis也会产生TeA[4]。

2.1 链格孢毒素在粮食中的污染现状

链格孢毒素广泛污染粮食、水果和蔬菜等农作物,存在多种链格孢毒素复合污染的现象,欧洲国家污染报道较多(表1),主要污染类型包括AME、TeA、TEN、AOH及ALT等。小麦、玉米及其制品主要受AOH、AME及TeA的链格孢毒素污染[60-67], 我国小麦样品也有TEN(Tentoxin)污染的相关报道[17]。

2.2 链格孢毒素的毒理学研究

链格孢毒素的毒性主要表现为细胞毒性、遗传毒性和致癌致突变性(表3)。AOH的细胞毒素表现在通过线粒体途径诱导细胞凋亡[68,69],引起细胞内活性氧水平升高,与DNA拓扑异构酶互作造成DNA断裂,细胞周期停滞在G2/M期,细胞增殖减少。AME具有诱变性,可造成DNA断裂和细胞周期停滞。醌类化合物ATX-Ⅱ 和ATX-Ⅲ 比AOH具有更强的诱变性[70,71]。此外,AOH通过干扰巨噬细胞分化和减少TNF-α分泌,在THP-1单核细胞中发挥免疫毒性作用[70,72]。AOH、AME和ALT与雌二醇结构相似,AOH处理引起类雌激素反应并干扰类固醇生物合成,通过雌激素作用增加孕酮和雌二醇含量,诱导孕酮受体表达水平增加。在猪颗粒细胞中,AOH和AME调控孕酮分泌和细胞活力[73]。AME腹腔注射处理叙利亚金仓鼠会导致母体和胎儿毒性,但不会导致畸形,AOH、AME和ALT暴露会导致依赖剂量的致畸现象[74]。ALT可引起NIH/3T3细胞基因损伤,导致DNApolβ表达上调[75]。TeA通过抑制核糖体蛋白质合成发挥毒性作用[76],会引起动物呕吐、心跳过速和出血性胃肠病。

表3 链格孢毒素的产生菌及其毒理学数据

3 总结与展望

针对粮食中的主要真菌毒素污染,通过风险评估、污染监测和较为系统的毒理学研究,目前国内外制定了限量标准,相应的防控技术也得以研发与应用。新兴真菌毒素的发生风险、污染动态和毒理学研究尚缺乏系统研究,目前尚未被列入常规风险监测。国内外围绕新兴毒素污染及其毒理学已开展了相关研究,文章综述分析粮食中主要新兴真菌毒素的污染类型、发生分布和毒理学相关研究进展。目前新兴镰刀菌毒素和链格孢毒素是粮食中主要的污染类型,污染分布广泛,其中,ENNs、BEA、FA、MON和TeA等在小麦、玉米、稻谷等主粮作物及饲料中污染严重,且存在多种新兴毒素与常见毒素复合污染的态势。毒理学研究表明, ENNA、ENNA1、ENNB1、BEA、MON、AOH、AME等具有遗传毒性,AOH、BEA和ENNB具有生殖毒性。建议将粮食中污染较为严重、毒性较强的新兴毒素纳入常规监测和风险评估体系,并围绕其产毒菌群遗传、毒素生物合成途径、产毒调控机制、污染风险形成机制和多毒素毒理效应等开展深入系统研究,结合污染数据和毒理学数据以及风险评估结果,提出标准制定建议,将为粮食中真菌毒素的全面风险评估和管控技术的研发提供参考。