Hsp90 在猪繁殖组织的表达特性与定位研究

陈 云，李 晨，陈丽圆，邓 晶，杨钰浩

（1.韶关学院 生物与农业学院，广东 韶关 512005；2. 韶关学院 广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室，广东 韶关 512005）

Hsp90 即热休克蛋白90，是热休克蛋白家族的成员，它广泛参与细胞的激素信号通路形成、细胞周期调控以及细胞发育等重要的生理过程，在雄性生殖过程中精子方面的变化以及分子层面的机制具有重要的意义［1］. 本课题组前期在高、低繁殖力公猪的精液iTRAQ 测序中，发现精子中Hsp90 蛋白的表达量，同精子膜的稳定性、与透明带的结合密切相关［2］. 高、低繁殖力荷斯坦公牛的精子和精清蛋白质组学测序中发现高繁殖力公牛的精子中Hsp90 的丰度更高，Hsp90 表达量与公牛繁殖力相关［3］. 研究发现，Hsp90 的表达与猪精子品质有着很大关系，影响猪精子的活力、质膜完整率和存活率等［4-5］，可能参与猪胚胎的发育过程［6］. Hsp90 可在多个物种的精子鞭毛中检测到，调节激酶活性、减数分裂和精子成熟，Hsp90 的下调可能造成精子缺陷，从而导致生殖异常和不育［7］. Hsp90 蛋白在猪精液冷冻保存方面发挥重要作用，在猪冷冻精液品质相关基因多态性的研究中，发现Hsp90 基因是与猪冷冻精液品种相关的标记基因［8］. 在牛精液和鸡精液中，均发现精子抗冻能力与Hsp90 基因的表达量相关，且Hsp90 基因的表达量可作为牛精子抗冻性的判断标准［9-10］. 目前，Hsp90 蛋白在猪精液冷冻保存和胚胎发育方面的研究，特别是有关精子活力与基因、蛋白间的理论研究比较匮乏，对它们的保护机理尚未通晓. 因此，本研究分析Hsp90 在猪繁殖组织、生殖细胞中的定位及表达，为猪精液冷冻添加剂的研究提供依据.

1 材料及方法

1.1 试验材料

1.样品：母猪卵巢和输卵管采于广州市某屠宰场；公猪的组织样品、精液采于广东省某种猪场.

2.主要试剂：AlexaFluor 568 羊抗兔二抗购于Thermo 公司；GAPDH 鼠单克隆抗体、Hsp90 兔多克隆抗体购于Abcam 公司；HRP 标记羊抗IgG 抗体、HRP 标记羊抗鼠IgG 抗体购于Earthox 公司；核酸清除剂购自上海泽叶生物科技有限公司；动物组织RNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix 和反转录试剂盒购自翌圣生物科技有限公司；Western blot 检测中用到的试剂均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；免疫组化检测用试剂均购自北京雷根生物技术有限公司；全蛋白提取试剂盒和BCA 蛋白含量检测试剂盒购自凯基生物有限公司；PBS、Hoechst 33342、矿物油和透明质酸酶购自Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取

取猪的卵巢、输卵管、睾丸、尿道球腺、前列腺、精囊腺、附睾头、附睾体、附睾尾等新鲜组织分别加入液氮迅速研磨后，根据RNA 抽提试剂盒说明书用提取各组织总RNA. 用超微量核酸测定仪对其浓度和纯度进行测定，用1%琼脂糖凝胶对其完整性进行检测，根据反转录试剂盒的操作说明合成cDNA.

1.2.2 引物设计与合成

根据NCBI 官网提供的猪源Hsp90 基因和内参基因GAPDH的mRNA 序列，利用Oligo 软件设计引物（表1），引物在上海生工生物公司合成［11］.

表1 RT-PCR 引物列表

1.2.3 RT-PCR 检测

RT-PCR 扩增体系（20 μL） ：上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，2×Taq PCR Mix 10 μL，模板1 μL，加ddH2O 至20 μL. 扩增采用三步法，即94 ℃30 s，94 ℃15 s，58 ℃2 min，72 ℃10 s，共30 个循环.

1.2.4 免疫印迹蛋白检测

取10～20 mg 动物组织，参考说明书提取组织蛋白，再参考BCA 蛋白含量检测试剂盒说明书检测总蛋白含量. 将组织蛋白按比例加入5×SDS 上样缓冲液沸水煮10 min 变性，在12%SDS-PAGE 凝胶上上样20 μg·孔-1，80 V 电泳3 h；将蛋白转至PVDF 膜，90 V 转膜1 h，脱脂奶粉室温封闭1 h；Hsp90 一抗孵育（1∶1 000 稀释），4 ℃过夜，TBST 洗膜2 次，TBS 洗膜1 次；二抗孵育，37 ℃摇床孵育2 h，洗膜同上；ECL 超敏发光液显色，曝光显影. 以内参GAPDH 进行目的蛋白表达量校正［12］.

1.2.5 免疫组化检测

获得成年公猪和母猪的新鲜样本，立即固定在10%的福尔马林中，常规石蜡包埋、切片，厚度为4 μm.二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水，抗原修复［12］. 添加兔源Hsp90 一抗（1∶500 稀释），4 ℃过夜，阴性对照为兔血清. 加HRP 标记的羊抗鼠二抗，37 ℃下孵育1 h，PBS 洗涤，DAB 显色，终止［12］. 苏木精复染细胞核，脱水封片，显微镜下观察切片颜色，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色［12］.

1.2.6 精子免疫荧光检测

取1 mL 精液，用PBS 洗涤3 次. 将50μL 精子悬浮液放在载玻片上，干燥60 min. 在室温下用3.7%甲醛固定20 min，PBS 洗涤，用10%正常兔血清封闭1 h，然后与稀释的Hsp90 抗体（82 μg·mL-1）或正常兔IgG 抗体（阴性对照，1 μg·mL-1）共同孵育，4 ℃过夜. PBS 洗涤，与荧光素偶联的山羊抗兔IgG（1∶1 000 稀释）在37 ℃孵育1 h，然后与Hoechst 33342（1∶100 稀释）避光室温孵育10 min. 通过激光扫描共聚焦显微镜检测Hsp90 蛋白.

1.2.7 卵母细胞免疫荧光检测

采集成年母猪的卵巢，抽取卵泡液，PBS 沉降3 次后，将卵母细胞的卵丘复合物用透明质酸酶去除，进行免疫荧光染色. 将卵母细胞吸入3.7%甲醛固定，37 ℃培养箱固定30 min 以上；PBS 洗涤3 次，37 ℃培养箱中放置2 h；一抗孵育，将卵母细胞放入提前做好的液滴中，37 ℃培养箱孵育4 h，清洗3 次；二抗孵育，步骤同上，室温孵育1 h，清洗卵母细胞；将Hoechest 33342 进行稀释（1∶100），在载玻片上做个液滴，放入卵母细胞，室温避光放置10 min. 封片，激光扫描共聚焦显微镜观察和拍照.

1.2.8 软件分析

RT-PCR 结果和Western blot 结果使用Image J 图像分析软件测定，采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计和显著性分析，结果用“平均值±标准误差”表示，*表示差异显著，0.01≤P＜0.05，**表示差异极显著，P＜0.01.

2 结果

2.1 Hsp90 基因在大白猪繁殖组织中的表达

利用RT-PCR 方法，以GAPDH基因为内参，检测猪繁殖组织Hsp90 基因的表达，结果显示，Hsp90基因在睾丸和附睾尾表达，在卵巢中微量表达，见图1.

图1 Hsp90 mRNA 在猪繁殖组织中的表达

2.2 Hsp90 蛋白在大白猪繁殖组织中的表达

利用Western blot 方法，以GAPDH 为内参，检测猪繁殖组织Hsp90 蛋白的表达，见图2，结果表明，Hsp90 蛋白在睾丸、卵巢、输卵管和精囊腺中表达［12］.

图2 Hsp90 蛋白在猪繁殖组织中的表达

2.3 Hsp90 蛋白的免疫组化

取新鲜的睾丸和卵巢组织，制作切片. 如图3，通过免疫组化方法，发现Hsp90 蛋白在睾丸的次级精母细胞、精子细胞和间质细胞中表达（图3B），也在卵巢的颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞中表达（图3D）.

图3 Hsp90 蛋白在猪睾丸和卵巢中的定位

2.4 Hsp90 蛋白在猪精子和卵母细胞中的表达

使用免疫荧光染色法，检测Hsp90 在精子和卵母细胞复合体中的表达. 如图4 及图5，Hsp90 在精子的颈部和尾巴中部表达（图4），也在卵丘细胞的细胞质和卵母细胞中表达（图5）.

图4 Hsp90 蛋白在猪精子中的表达

图5 Hsp90 蛋白在猪卵丘-卵母细胞复合体中的表达

3 讨论

Hsp90 蛋白浓度在猪精液冷冻过程中发生了显著的变化，冷冻使猪精子的化学组成和结构都发生了显著的改变，而猪精子中蛋白质的变化对猪精子冷冻效率具有极其重要的影响［13］. 冷冻保存可以有效提高种精液的利用率和延长精液的使用时间［14］. 但在冷冻解冻后，大部分精子的活力丧失，导致精子品质下降，繁殖力下降，从而影响优良种公猪的种用价值. 伴随着猪精子冷冻程序的进行，Hsp90 的表达量逐渐降低，且其表达量下降开始于精子品质下降之前，Hsp90 表达量的大幅降低可能与冷冻过程中猪精子的活率下降相关［15］. 随后，Huang 等利用Hsp90 的抑制剂格尔德霉素进一步验证了Hsp90 与精子活力的关系，结果证明Hsp90 在调控猪精子活力方面发挥了重要作用［16］，格尔德霉素增加一氧化氮的产生并促进公猪精子获能［17］. 另外，Hsp90 在非获能条件下长时间热应激期间维持公猪精子活力和线粒体膜电位的作用，在获能条件下，所研究的精子参数在孵育4 h 后均不受Hsp90 抑制剂的影响［18］.

Hsp90 调控生精细胞的分裂，参与精子发生过程，在生殖细胞的快速定位、精子微管的形成、保护精子免受氧化应激、调节获能等过程中发挥不可缺少的作用［1，19-21］. Volpe 等研究发现，Hsp90 定位于猫精子尾部的中段，马的精子则是在颈部和尾部的全段，但在猪精子上的定位是在精子中段的原生质粒上，在猪精子的免疫荧光图片上，荧光信号在中段的近端和远端末端以小单点的形式持续存在［22］. 在本试验中，可以清楚地看到Hsp90 蛋白在精子的颈部和尾部中段表达，本研究在前人的基础上，更加确定了Hsp90 蛋白在精子中的位置，结果的差异可能与精子的成熟、品种和抗体种类有关. Hsp90 在颈部和尾部的定位与其在精子运动中的作用有关，但需要进一步的研究来证明这些分子与精子的运动和受精能力的功能相关性［23］.研究发现，卵母细胞质量的优劣取决于细胞核和细胞质是否发育成熟，当两者都发育成熟的时候，才能进行受精；卵母细胞的成熟依赖于卵丘细胞，它们之间进行营养物质和信号分子转运［24］. 在热中性或热休克条件下体外成熟期间抑制Hsp90 会损害牛卵母细胞的发育能力［25］. 本研究发现Hsp90 在猪卵母细胞和卵丘细胞中表达，该蛋白可能对卵母细胞与卵丘细胞之间交流互作产生影响，可为相关生理机制的研究提供基础数据.

本研究结果显示Hsp90 在猪主要的繁殖组织和生殖细胞中高表达，可为我国猪精液冷冻技术和胚胎发育的研究提供理论基础. Hsp90 蛋白的表达与猪精子品质的提高息息相关［26-27］，该精液蛋白的直接影响精子的活力和获能，对猪精液冷冻添加剂的研究具有指导价值. 另外，研究发现，将重组Hsp90 蛋白加入鸡精液稀释剂中，解冻后的精子活力显著提高［28］. 后续研究的设计是建立表达猪源Hsp90 蛋白的细胞系，获得重组蛋白Hsp90，将其加入猪精液稀释剂中，为解冻融精子冷冻损伤的潜在分子机制和提高冻融猪精子生育能力提供新思路和实验数据.

4 结论

综上所述，在组织层面发现Hsp90 主要在猪的睾丸和卵巢中高表达；在细胞层面发现Hsp90 在睾丸的间质细胞、次级精母细胞和精子细胞中表达，在卵巢的卵母细胞、卵丘细胞和颗粒细胞中表达，Hsp90 蛋白定位在精子的颈部和尾巴中部，以及卵丘细胞的细胞质和卵母细胞中.