鸡circSFMBT2 克隆及对DF-1 细胞增殖的影响

焦振海，王府建，张 丽，李 国，宾乘锋，张为露，郭东雪，王晓彤，林树带

(广东海洋大学 滨海农业学院，广东 湛江 524088)

环状RNA(circRNA)是一种共价闭合环状内源性RNA，广泛存在于真核生物中[1]。由于反向剪接效率不高，因此表达水平较低[2]。然而一旦形成circRNA 就稳定存在，并且具有高度保守性[3]。与线性RNA 相比，circRNA 不含5′帽子和3′尾巴，半衰期更长，不易被RNase R 降解[4]。此外，circRNA 还具有组织、时间和疾病表达特异性等特点[5-6]。近年来的研究发现，circRNA 具有多种生物学功能，主要包括调控基因转录，充当miRNA 海绵，与蛋白质结合参与调控和编码蛋白质等生物学功能[7-8]。研究发现，circRNA 在肌肉发育过程中发挥作用，如circFUT10 可作为miR-133a 的海绵，在牛原代成肌细胞增殖分化中发挥功能[9]，而circZNF609 存在开放阅读框，并能翻译成多肽发挥促进成肌细胞增殖的作用[10]。

SFMBT2(Scm-like with four MBT domains 2)是多梳基因，可以编码具有MBT 结构域的染色质调节蛋白，在多种基因的遗传调控中发挥作用[11-12]。鸡SFMBT2基因定位于1 号染色体，含有21 个外显子。广东海洋大学家禽育种团队的高通量测序(BioProject 登录号：PRJNA554754)发现SFMBT2存在环状转录本，本研究通过PCR 和测序技术手段验证circSFMBT2 的环状结构，分析其结构特征和表达规律，并在DF-1 细胞中初步研究其对细胞增殖的影响，以期为后续深入分析circSFMBT2在鸡骨骼肌发育过程中的作用及机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

麒麟鸡种蛋采购于广东省高州市万农种鸡场。DF-1 细胞系由华南农业大学家禽遗传育种团队赠送。RNA 抽提试剂盒、RNA 反转录试剂盒、无内毒素质粒抽提试剂盒购自广州美基生物科技有限公司；荧光定量PCR 酶、大肠埃希菌EscherichiacoliDH5α 感受态细胞购自北京全式金公司；环状RNA 过表达载体pCD2.1-ciR 购自吉赛生物科技有限公司；KpnI、BamH I 购自TAKARA公司；DMEM 高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集与细胞培养 将麒麟鸡种蛋放在37 ℃、湿度为70%的自动孵化箱中孵化，分别采集14 胚龄、16 胚龄、18 胚龄以及1～6 周龄麒麟鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌和腿肌等组织，液氮速冻后迅速保存于-80 ℃冰箱中，用于组织表达规律和时序表达规律分析。

DF-1 是可以无限增殖的成纤维状细胞系，在完全培养基(DMEM 高糖+体积分数为10%的胎牛血清+体积分数为1%的双抗)37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。

1.2.2 引物设计与circSFMBT2 验证 针对circSFMBT2 的成环位置，在接头两端设计特异性引物circSFMBT2-D，用于circSFMBT2 环分子的验证，设计全长扩增引物circSFMBT2-full，用于克隆circSFMBT2 的全长序列，内参基因选用GAPDH。引物通过primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计。为验证circSFMBT2的连接位置，使用RNase R 外切酶在37 ℃条件下处理RNA 样品30 min，反转录成cDNA，分别使用circSFMBT2-D 和circSFMBT2-full 引物进行PCR 扩增，将扩增产物送生工生物技术有限公司测序。引物信息见表1。

表1 引物序列及用途Table 1 Sequences and uses of primers

1.2.3 组织和细胞RNA 提取及qPCR 试验 组织和细胞总RNA 的提取方法参考HiPureUnivesal RNA Mini Kit 试剂盒说明书。依据PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒说明书，使用随机引物(N9)和Oligo-d(T)18将总RNA 反转录为cDNA，反应程序为25 ℃，10 min；42 ℃，15 min；85 ℃，30 s。以反转录生成的cDNA 为模板进行实时荧光定量PCR，PCR 反应体系：cDNA 模板1 μL、上、下游引物各0.4 μL、2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL、双蒸水8.2 μL。PCR 反应条件为94 ℃，3 min；94 ℃，15 s，60 ℃，15 s，72 ℃，20 s，40 个循环。溶解曲线程序为95 ℃，15 s；60 ℃ 1 min；9 5 ℃，1 s。以GAPDH作为内参基因，检测circSFMBT2 的表达。

1.2.4 鸡circSFMBT2 过表达载体构建 根据circRNA 的测序数据，通过PCR 扩增circSFMBT2的全长序列，并在其两端加上保护序列和酶切位点，使用KpnI 和BamH I 酶切PCR 扩增产物和pCD2.1-ciR 载体，酶切产物纯化后利用T4DNA 酶连接，16 ℃过夜。取连接产物转化至大肠埃希菌感受态细胞中，转化完成后涂板，37 ℃恒温培养14～16 h，挑取单克隆菌落，阳性鉴定后送测序，选取测序结果与circSFMBT2 基因序列吻合的单克隆菌液留用。

1.2.5 细胞转染试验 将DF-1 细胞系接种于12 孔板，使用DMEM 完全培养基培养细胞至汇合度达80%时，使用脂质体转染试剂Lipofectamine@3000 转染空载体pCD2.1-ciR 和过表达载体pCD2.1-circSFMBT2，转染48 h 后收获细胞。

1.2.6 Edu 和CCK-8 检测细胞增殖 转染空载体pCD2.1-ciR 和过表达载体pCD2.1-circSFMBT2 至48 h，参考Edu 试剂盒说明书对细胞进行孵育、固定、通透、染色等处理，最后在荧光显微镜下观察和拍照。

CCK-8 试验：将细胞接种于96 孔板，转染空载体pCD2.1-ciR 和过表达载体pCD2.1-circSFMBT2，分别在0、12、24、36、48 和60 h 使用CCK-8 试剂37 ℃孵育2 h 后，检测细胞的D450nm。

1.2.7 生物信息学分析 利用RNAhybird 网站在线预测circSFMBT2 中潜在的miRNA 结合位点，使用SnapGene 软件预测circSFMBT2 编码蛋白质的能力。

1.2.8 统计学分析 Edu 试验与基因定量检测中每个分组包含4 个重复，CCK-8 试验中每组包含8 个重复，使用GraphPad Prism9 软件进行统计学分析，采用t检验分析数据。CircSFMBT2 时序表达规律和组织表达规律数据采用LSD 多重比较进行分析。

2 结果与分析

2.1 鸡circSFMBT2 成环验证

根据华南农业大学家禽遗传育种与繁殖实验室前期高通量测序结果，发现鸡SFMBT2基因可能产生一个环状转录本，为此，本研究首先对circSFMBT2 连接成环位置设计发散引物，以1 周龄麒麟鸡肝脏组织RNA 反转录的cDNA 为模板进行PCR 扩增。PCR 电泳结果产生了预期目的条带(图1A)，测序结果显示，circSFMBT2连接成环的片段来源于SFMBT2基因外显子12 和外显子18(图1B、1C)。

图1 鸡circSFMBT2 成环验证Fig.1 Validation of the junction of chicken circSFMBT2

线性RNA 在RNase R 外切酶的作用下很容易降解，但circRNA 具有RNase R 耐受性。为了进一步验证circSFMBT2 的环形结构，对麒麟鸡肝脏组织的RNA 分别以RNase R 未处理和处理后，采用实时荧光PCR 定量circSFMBT2 和SFMBT2mRNA的相对表达量，试验结果表明，使用RNase R 处理后，SFMBT2mRNA 的相对表达量显著下降，而circSFMBT2 的相对表达量无明显变化(图2A)。另外，分别使用Oligo-d(T)18和随机引物(N9)反转录成cDNA，实时荧光定量PCR 结果表明，SFMBT2mRNA 在Oligo-d(T)18和随机引物组中的表达量无显著变化，而采用O l i g o-d(T)18反转录的circSFMBT2 的表达量显著低于随机引物组(图2B)。进一步证实circSFMBT2 具备环状分子的特点。

图2 circSFMBT2 和SFMBT2 mRNA 对RNase R 耐受性和反转录分析Fig.2 Tolerance of the chicken circSFMBT2 and SFMBT2 mRNA to RNase R and reverse transcription analysis

2.2 鸡circSFMBT2 的组织表达谱

分别提取麒麟鸡14 胚龄和1 周龄心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肺脏、胸肌和腿肌等组织RNA，反转录成cDNA 后，通过荧光定量PCR 对circSFMBT2和SFMBT2mRNA 的表达量进行对比分析。发现circSFMBT2 和SFMBT2mRNA 的组织表达规律存在一定的相似性，两者都在14 胚龄和1 周龄脾脏和肺脏中高表达，而在胸肌和腿肌中低表达(图3)。

图3 麒麟鸡 circSFMBT2 和SFMBT2 mRNA 组织表达谱Fig.3 circSFMBT2 and SFMBT2 mRNA expression profiles in tissues of Kirin chickens

2.3 鸡胸肌和腿肌circSFMBT2 时序表达规律

提取麒麟鸡不同发育阶段胸肌和腿肌组织RNA，反转录后定量分析的结果 (图4)表明，circSFMBT2与SFMBT2 在胚胎时期的表达量相对较高，而出生后两者的表达量急剧下降，同时circSFMBT2 在胸肌的表达量下降趋势更为明显。

图4 麒麟鸡circSFMBT2 和SFMBT2 mRNA 的时序表达规律Fig.4 Temporal expression pattern of circSFMBT2 and SFMBT2 mRNA of Kirin chickens

2.4 鸡circSFMBT2 对DF-1 细胞增殖的影响

2.4.1 CCK-8 试验结果 在鸡DF-1 细胞中过表达circSFMBT2，荧光定量PCR 结果证实过表达效果显著(图5A)，pCD2.1-circSFMBT2 过表达质粒可用于后续试验。为了验证过表达后circSFMBT2对细胞增殖的影响，通过转染pCD2.1-circSFMBT2和 pCD2.1-ciR，收集转染后24、36、48 和60 h 的细胞，进行CCK-8 试验，结果显示，与pCD2.1-ciR组相比，circSFMBT2 过表达48 h 后，DF-1 细胞活力上升(图5B)。

图5 过表达鸡circSFMBT2 对DF-1 细胞增殖的影响Fig.5 Effect of chicken circSFMBT2 overexpression on proliferation of DF-1 cells

2.4.2 Edu 试验结果 为进一步分析circSFMBT2对细胞增殖的影响，在DF-1 细胞中同时转染pCD2.1-ciR 和pCD2.1-circSFMBT2 质粒，培养48 h 后对渗入细胞总数进行分析，结果表明过表达组Edu 细胞渗入总数高于对照组(图6、7)，circSFMBT2过表达后可以促进DF-1 增殖。

图6 转染pCD2.1-ciR 和pCD2.1-circSFMBT2 后荧光显微镜下的细胞状态(标尺=250 μm)Fig.6 Cell state under fluorescence microscope after transfected with pCD2.1-ciR and pCD2.1-circSFMBT2(Scale bar=250 μm)

图7 Edu 中阳性细胞统计结果Fig.7 Statistical results of positive cells in Edu

2.4.3 circSFMBT2 对细胞增殖标记基因表达的影响 在CCK-8 和Edu 试验基础上，为了进一步验证circSFMBT2 对DF-1 细胞增殖的影响，在转染pCD2.1-ciR 和pCD2.1-circSFMBT2 质粒24、36、48和60 h 后，qRT-PCR 检测对照组和过表达组增殖标记基因PCNA、CDK2和CCND1表达趋势。结果显示试验组中增殖标记基因CCND1在36 和48 h 表达量高于对照组，并且CCND1和PCNA的表达量在48 h与对照组差异显著，CDK2的表达量无明显变化(图8)。

2.4.4 circSFMBT2 生物学功能预测 利用RNAhybird 在线预测 circSFMBT2 潜在的靶标位点，发现circSFMBT2 存在miR-103、miR-107 和let-7b 等靶标位点，另外，使用SnapGene 软件预测circSFMBT2 存在1 个开放阅读框，编码蛋白质能力得分为0.936 0，推测其具有较强编码小肽的潜能。

3 讨论与结论

在华南农业大学家禽遗传育种与繁殖实验室前期研究的基础上，本研究验证了鸡 circSFMBT2由SFMBT2基因外显子12 至外显子18 反向剪切形成。查阅circBase(http://www.circbase.org)发现，人SFMBT2也存在环状RNA，人circSFMBT2 由亲本基因的外显子5 至外显子8 组成。研究发现，人circSFMBT2 可作为miR-182-5p 海绵调控胃癌细胞的增殖[13]，也可通过靶向miR-7-5p 对肺癌细胞产生影响[14]。

由于环状RNA 的闭环结构，不易被RNase R 降解，具有较强的稳定性。本研究发现，与线性SFMBT2相比，鸡circSFMBT2 具有较强的RNase R 耐受性，并且随机引物(N9)相比于Oligo-d(T)18引物具有更高的反转录效率，进一步说明鸡circSFMBT2 具备环状分子的基本特征。鸡circSFMBT2 还具有时空表达的特异性，本试验通过荧光定量发现，鸡circSFMBT2 与线性转录本在胸肌和腿肌时序表达规律相似，其在胚胎时期表达量较高，而出生后(1～6 周)表达量迅速下降，推测可能与线性转录本低表达有关。鸡circSFMBT2 在组织中的表达具有差异性，circSFMBT2 在14 胚龄与1 周龄鸡肺脏组织表达量最高，在肌肉组织表达量极低。

目前，已有大量文章报道circRNA 在细胞中发挥调控作用，如在牛原代成肌细胞中，发现circLMO7能抑制成肌细胞分化促进细胞增殖[14]。在家禽中，circSVIL 可以通过结合miR-203 从而促进成肌细胞的增殖和分化[15]。在细胞增殖试验中，我们发现过表达circSFMBT2 48 h 后，增殖标记基因PCNA和CCND1的表达量升高，但CDK2的表达量无明显变化。CCK-8 与Edu 试验表明，过表达cicrSFMBT2 可促进DF-1 细胞的增殖。

研究发现，circRNA 具有多种生物学功能。一些circRNA 含有miRNA 应答原件，竞争性与miRNA 结合，发挥miRNA 海绵作用[16]，circRNA也可在转录后调控亲本基因的表达[17-20]。一些定位在细胞核中的circRNA 可以与RNA 聚合酶 Ⅱ 结合调控亲本基因的转录活性[7]，含有内含子序列的circRNA 通过RNA-RNA 相互作用与U1 小核核糖体蛋白结合，进一步与RNA 聚合酶 Ⅱ 结合促进亲本基因的转录[21]，也可以与DNA 结合形成RNADNA 杂交环，在剪接过程中调控亲本基因的表达[22]。

随着circRNA 的研究深入，人们发现有些circRNA 具有开放阅读框，能编码蛋白质[23]。circSFMBT2 含有8 个外显子，利用RNAhybird 在线预测发现circSFMBT2 存在miR-103 和miR-107 等靶标位点，另外，使用SnapGene 软件预测发现circSFMBT2 存在1 个开放阅读框。我们期待更深入的研究，验证circSFMBT2 能否作为miRNA的海绵或编码小肽，是否调控线性基因转录，并验证其是否参与调控鸡肌肉生长发育。