地衣芽孢杆菌产芽孢培养基和培养条件的优化

董 雪， 刘晓露， 李丽蓓， 刘妩妍， 雷 浩， 樊 霞

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京海淀 100081；2.陕西秦云农产品检验检测股份有限公司，陕西渭南 714000）

目前，我国饲料行业已进入绿色高质量发展新阶段。 2019 年，农业农村部发布第194 号公告，规定从2020 年7 月1 日起， 饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料，饲料行业正式迈入“禁抗”新纪元。 基于饲料全面禁抗的背景，饲料中的“替抗”产品蓬勃发展，微生态制剂亦列其中，成为研发热点，《2021 年全国饲料工业发展概况》显示我国微生态制剂型饲料添加剂产量同比增幅达17.4%，行业发展迅速。

饲用微生物亦称饲用益生菌、 微生态制剂，《饲料添加剂品种目录》（2013）及其修订版中列出了34 种绿色无毒、健康环保、增效显著的功能性微生物允许在饲料生产中使用，主要包括酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌、部分光合细菌和少数曲霉（王秋菊等，2018）。 芽孢杆菌在生物体和环境中广泛存在，是饲养环境中的天然菌群，由于能够产生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等功能性酶，因此在农业、医药卫生及工业等领域具有重要应用价值（雷新雨等，2021；潘慧青等，2019）。 与传统的益生菌相比， 以芽孢休眠体形式存在的芽孢杆菌具有更强抗逆性，耐高温、耐酸碱、耐挤压、货架期长，生产成本低于乳酸菌和酵母菌，适用范围广，进入养殖动物消化系统后也能保持高度的稳定性（Cheng等，2021；Popov 等，2021）。 枯草芽孢杆菌 （于洁等，2020）、地衣芽孢杆菌（陈雪颖等，2022）、凝结芽孢杆菌（乔欣君，2021）等为目前养殖过程中使用最广泛的三种益生芽孢杆菌。

地衣芽孢杆菌作为生产饲用芽孢杆菌制剂的主要菌种之一，其发酵能够产生肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类等多种抗菌物质，产出的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶具有良好的活性， 在保持养殖动物肠道微生态系统平衡、 提高动物机体抗病能力等方面均具有显著作用（Muras 等，2021）。 但目前市场中菌剂制品最大的限制是易受温湿度等储存条件的影响，产品保质期较短，若使用时有效活菌数未能达到标准规定值（1.0×109CFU/mL 或g）将会影响作用效果， 故大部分产品在生产过程中会通过筛选培养基和培养条件来提高有效成分，或通过工艺优化和添加保护剂等方式减少产品有效活菌数的衰亡等（Wang 等，2021；Dianawati 等，2013）。 孙标等（2021）通过优化发酵工艺获得凝结芽孢杆菌产芽孢最佳培养基组分和培养条件，最终产芽孢数达到2.848×1010CFU/mL，相比优化前提高了61.72%。赵甜宇等（2020）在研究枯草芽孢杆菌固态菌剂制备工艺时， 通过单因素和正交试验获得最适芽孢形成的液态发酵培养基组成与培养条件，芽孢数最高可达1.1×1010CFU/mL。 Su等（2019） 在解淀粉芽孢杆菌摇瓶发酵中优化工艺使芽孢产量提高了25.7 倍， 湿基质芽孢浓度达到7.24×1010CFU/g。

本研究采用单因素和正交试验的方法对地衣芽孢杆菌CICC 20514 产芽孢发酵培养基组成和培养条件进行优化， 旨在提高发酵液中芽孢数量及比例， 为后续地衣芽孢杆菌制品的开发及延长相应产品货架期奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与材料 TU-1901 双光束紫外可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限责任公司），ZWY-100H 恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司），GI54DWS 高压灭菌器（厦门致微仪器有限公司），AC2-4S1 生物安全柜（新加坡ESCO 科技有限公司），CX33 生物显微镜（日本OLYMPUS 株 式 会 社），SHP-080 生 化 培 养 箱 等（上海精宏试验设备有限公司）。

地衣芽孢杆菌（编号：CICC 20514）购自中国工业微生物菌种保藏中心；牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、营养肉汤、营养琼脂（北京陆桥技术股份有限公司）；蔗糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖蜜、磷酸氢二钾、碳酸钙（北京索莱宝科技有限公司）；硫酸锰、硫酸镁（上海麦克林生化科技有限公司）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）。基础发酵培养基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、K2HPO44 g/L、MnSO40.4 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 生长曲线测定 将地衣芽孢杆菌CICC 20514 接种于营养琼脂平板37 ℃培养18 ~ 24 h，取平面培养物加无菌生理盐水制成约108CFU/mL菌悬液， 以5%接种量接种于50 mL 无菌营养肉汤中，置于37 ℃，220 r/min 恒温摇箱中培养。 以生理盐水为空白对照， 每隔4 h 测定种子液的OD600nm值，每个处理重复3 次。

1.2.2 地衣芽孢杆菌测定 活菌数： 将发酵液按10 倍稀释法制成不同浓度稀释液， 选择2 ~ 3 个连续的适宜稀释度，吸取0.2 mL 接种于营养琼脂平板内，涂布棒涂布，每个稀释度接种2 个平板。待接种物被培养基完全吸收， 倒置平皿水平放于（37±1）℃培养箱中培养（48±2）h，进行菌落计数。

芽孢数：将发酵液按10 倍稀释法制成不同浓度稀释液， 选择2 ~ 3 个连续的适宜稀释度，置（80±1）℃水浴10 min，冷却至室温后吸取0.2 mL接种于营养琼脂平板内，涂布棒涂布，每个稀释度接种2 个平板。待接种物被培养基完全吸收，倒置平皿水平放于（37±1）℃培养箱中培养（48±2）h，进行菌落计数。

芽孢率/%=芽孢数（CFU/mL）/活菌数（CFU/mL）×100。

1.2.3 碳源成分及浓度筛选 基础发酵培养基其他成分不变，以10 g/L 的果糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖蜜代替葡萄糖筛选碳源成分。 将已 筛 选的 最 佳 碳 源 按 照5、10、15、20、25、30 g/L浓度添加，筛选产芽孢最佳碳源浓度。

1.2.4 氮源成分及浓度筛选 在单因素筛选的最佳碳源及浓度基础上，以10 g/L 的蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、玉米浆、豆粕、花生饼粉代替基础发酵培养基中的混合氮源，筛选氮源成分。将已筛选的最佳氮源按照5、10、15、20、25、30 g/L 浓度添加，筛选产芽孢最佳氮源浓度。

1.2.5 无机盐成分及浓度筛选 在已筛选的最佳碳氮源及浓度基础上， 分别用1、3、5、7、9 g/L 的K2HPO4和NaCl，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的Mn-SO4、MgSO4和CaCO3， 代替基础发酵培养基中的无机盐成分，筛选无机盐成分及浓度，选择具有促芽孢生成效果的无机盐及其浓度进行正交试验，筛选最优搭配组合。

1.2.6 接种量筛选 以发酵产芽孢培养基最优搭配组合为基础， 按1%、3%、5%、7%、9%接种量将种子液接种发酵培养基中，37 ℃，220 r/min 培养48 h 筛选最佳产芽孢接种量。

1.2.7 装样量筛选 按10%、15%、20%、25%、30%装样量将发酵培养基置500 mL 锥形瓶中， 以最佳接种量接种种子液，37 ℃，220 r/min 培养48 h 筛选最佳产芽孢装样量。

1.2.8 发酵液初始pH 筛选 按最佳装样量配制发酵培养基后， 用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 调节发酵培养基pH 至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 后灭菌，按最佳接种量接种种子液，37 ℃，220 r/min 培养48 h 筛选最佳产芽孢初始pH。

1.2.9 发酵培养时间筛选 以NY/T 1461-2007《饲料微生物添加剂 地衣芽孢杆菌》 中培养时间48 h 为依据，分别将48、60、72、84、96 h 作为发酵培养时间进行活菌和芽孢计数， 筛选最佳产芽孢发酵培养时间。

2 结果

2.1 生长曲线测定 地衣芽孢杆菌以5%接种量接种至50 mL 的营养肉汤，37 ℃，220 r/min 条件下培养36 h，生长曲线如图1 所示。0~4 h 生长缓慢，为延滞期；4 ~ 20 h 大量增殖，为对数生长期；20~36 h 趋于平稳，为稳定期。 为获取较高浓度种子液且保持菌株的生长活力，通常选用对数生长末期和稳定生长前期进行发酵液的接种，因此本研究选择16~20 h 作为种子液培养终止时间。

图1 地衣芽孢杆菌CICC 20514 生长曲线

2.2 产芽孢培养基成分及浓度筛选

2.2.1 碳源成分及浓度筛选 碳源是微生物碳架的组成部分， 也是多数微生物生长不可缺少的营养物质。 本研究将10 g/L 葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉和糖蜜作为培养基的碳源，以芽孢数和芽孢率为指标进行筛选， 结果如图2 所示。不同碳源对产芽孢数和芽孢率具有显著影响，其中蔗糖最低且低于对照培养基，以果糖、可溶性淀粉和玉米淀粉为碳源的发酵培养基的芽孢数显著高于其他处理组（P < 0.05；图2A），此三组间虽差异不显著，但以果糖为碳源的发酵培养基芽孢率明显高于玉米淀粉和可溶性淀粉，符合扩大生产和研究目的， 因此确定果糖为地衣芽孢杆菌CICC 20514 发酵产芽孢培养基的最佳碳源。 再以果糖为碳源进行最佳浓度筛选，结果如图2B 所示。 发酵液中芽孢数在5 ~ 25 g/L 果糖浓度内差异不显著（P>0.05），其中20 g/L 芽孢数最高，30 g/L 浓度下芽孢数显著下降。 从芽孢率结果可知，随果糖浓度的升高芽孢率整体呈下降趋势， 其中5 g/L 芽孢率最高，10~20 g/L 相近， 其中20 g/L 芽孢率相对最高，25~30 g/L 芽孢率很低； 同时考虑到活菌数对芽孢率计算的影响，5 g/L 果糖的活菌数为浓度梯度中最低，故最终选择20 g/L 果糖作为最佳碳源浓度。 整体结果也可以说明果糖为速效碳源，能够直接供给菌体所需营养物质，促进活菌增殖，但过高的糖浓度对后期芽孢的形成有抑制作用。

图2 碳源及浓度菌落计数筛选结果

2.2.2 氮源成分及浓度筛选 氮源是微生物构成菌体蛋白和DNA 等含氮物质的必要营养成分。 本研究预试验发现，无机氮源对CICC 20514 地衣芽孢杆菌产芽孢无明显促进作用， 因此选用蛋白胨、酵母浸粉、玉米干浆、花生饼粉、豆粕6 种有机氮源进行发酵培养基的氮源筛选。不同氮源对发酵液中芽孢数的影响见图3A。 添加有机氮源的处理组芽孢数和芽孢率均高于对照组，其中以酵母浸粉为氮源的培养基发酵后的芽孢数最低且与其他处理组呈显著性差异，以蛋白胨、牛肉浸粉和玉米干浆为氮源的培养基发酵后的芽孢数无显著性差异，以花生饼粉和豆粕为氮源的培养基促芽孢生成效果明显高于其他处理组（P < 0.05），但以豆粕为氮源的培养基发酵后的芽孢数及芽孢率平均值较高，因此选用豆粕作为最佳氮源。随后对豆粕的添加浓度进行对比，结果见图3B。 随着豆粕浓度的升高，发酵液芽孢数和芽孢率均呈先上升后下降的趋势，其中在15 ~ 20 g/L 浓度间芽孢数差异不显著 （P >0.05）， 但20 g/L 豆粕浓度的芽孢率远高于15 g/L，故选用20 g/L 豆粕作为最佳氮源浓度。

图3 氮源及浓度菌落计数筛选结果

2.2.3 无机盐成分及浓度筛选 无机盐是菌体在生长和繁殖过程中不可缺少的生理活性物质，其中金属离子在一定浓度范围内可以促进芽孢形成。本研究以20 g/L 果糖、20 g/L 豆粕为基础分别添加5种不同浓度的无机盐进行促芽孢生成效果的比较，结果如图4 所示。 与对照组相比K2HPO4和NaCl均具有明显促芽孢生成作用，且随着添加浓度的升高芽孢数和芽孢率均呈先上升后下降的趋势，最佳产芽孢浓度均为5 g/L。MgSO4在0.4~0.8 g/L 浓度下芽孢数明显高于对照组，CaCO3在0.4 ~ 1.0 g/L浓度下对芽孢生成有明显促进作用，两者作用效果稳定性良好，芽孢数均在0.6 g/L 达到最高值。 Mn-SO4在本研究中与对照组差异较小（P>0.05），该浓度范围促芽孢生成作用不明显。

图4 无机盐及浓度菌落计数筛选结果

根据单因素试验结果， 为进一步提高芽孢数量，以20 g/L 果糖和20 g/L 豆粕为基础，分别选取K2HPO4、CaCO3、NaCl 和MgSO4进行L9（43）正交试验，因素水平设计及结果见表1。 芽孢数极差排序为RD>RB>RC>RA，最佳搭配组合为A2B2C3D3，芽孢率极差排序为RB>RD>RC>RA， 最终的优化方案也为A2B2C3D3。 表2 方差分析结果显示， 无机盐CaCO3、K2HPO4和MgSO4均对发酵液芽孢数量 有显著性影响， 且主次因素为CaCO3＞K2HPO4＞Mg-SO4； 表3 方差分析结果表明， 无机盐CaCO3和K2HPO4对发酵液芽孢率有显著影响，影响作用为K2HPO4＞CaCO3。

表2 无机盐正交试验芽孢数结果方差分析

表3 无机盐正交试验芽孢率结果方差分析

综上，芽孢数和芽孢率的最佳发酵液无机盐搭配组合均为A2B2C3D3，未在正交试验表中，需进行验证试验， 因A 因素极差较小， 可将A1B2C3D3、A3B2C3D3、A1B3C3D3试验方案与正交表中芽孢数和芽孢率最高的A2B2C3D3进行比较， 选择最优组合。验证试验结果如图5 所示，地衣芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的最佳搭配组合为A2B2C3D3，即20 g/L 果糖、20 g/L 豆粕、7 g/L NaCl、5 g/L K2HPO4、0.8 g/L CaCO3和0.8 g/L MgSO4。

图5 正交搭配组合菌落计数筛选结果

2.3 产芽孢培养条件优化

2.3.1 接种量筛选 不同接种量对发酵液产芽孢数量也具有一定影响， 本研究设置5 个梯度接种量，结果见图6，在1%~9%接种量，芽孢数和芽孢率均随接种量的增加呈先上升后下降的趋势，其中5%接种量的芽孢数最多，3%和7%接种量与之相比差异不显著 （P > 0.05）；1%接种量的芽孢率最低，3%~9%接种量的芽孢率相近，其中5%接种量的芽孢率最高，故芽孢杆菌的最佳接种量为5%。

图6 接种量对芽孢数和芽孢率的影响

2.3.2 装样量筛选 本研究采用锥形瓶（500 mL）进行装样量的试验，容器剩余空间大小可能也对芽孢率和芽孢数产生影响，结果见图7。随着装样量的增多， 产芽孢数和芽孢率均呈现逐渐下降的趋势，装样量在10%~20%芽孢数和芽孢率均无显著性差异且明显高于其他处理组（P < 0.05），为方便后续发酵液的大量收集，研究的最佳装样量为20%。

图7 装样量对芽孢数和芽孢率的影响

2.3.3 发酵液初始pH 筛选 发酵液初始pH 对地衣芽孢杆菌产芽孢能力的相关研究较少， 本研究对此因素进行探讨，结果如图8 所示。产芽孢数和芽孢率在pH 6 ~ 8 均呈现先下降后上升趋势，发酵液初始pH 维持在6.5 ~ 7.5 芽孢数量和芽孢率较高，且三组间结果间差异不显著（P > 0.05），初始pH 在6 和8 时产芽孢能力均显著低于三组中性条件， 说明芽孢杆菌产芽孢能力在中性条件下比较稳定， 偏酸性或偏碱性都会减弱其产芽孢数量和芽孢率。

图8 初始pH 对芽孢数和芽孢率的影响

2.3.4 发酵培养时间筛选 地衣芽孢杆菌生长曲线测定时发现36 h 的发酵液中芽孢数量较少，因此本研究自发酵培养48 h 开始取样并持续观察至发酵培养的96 h。 结果如图9 所示。 发酵液终止培养时间在48 ~ 72 h 芽孢数量无明显差异（P> 0.05）， 芽孢率也无明显差异，84 ~ 96 h 发酵液芽孢数量和芽孢率均有所下降， 本着节能提效的宗旨，本研究选用48 h 作为发酵终止培养时间。

图9 发酵培养时间对芽孢数和芽孢率的影响

3 讨论

自然界微生物生长依赖于天然营养物，而实验室或企业通常选择人工合成的培养基来获得目标微生物， 不同的微生物所需营养物质种类和浓度有很大差异， 因此需要通过一定的科学方法筛选和优化培养基配方， 以找到适宜特定微生物生长繁殖并获得目标产物的营养组分和比例（李金荣等，2022）。 Khardziani 等（2017）研究影响枯草芽孢杆菌孢子产量关键因素时发现， 葡萄糖及浓度对芽孢形成能力的表达起着至关重要的作用。 魏强等（2019）优化地衣芽孢杆菌10236 发酵条件发现最佳碳源是葡萄糖，葡萄糖是大多微生物能够直接利用的单糖， 本研究以提高CICC 20514 地衣芽孢杆菌的产芽孢数量为目标，对培养基组成进行优化，在筛选碳源时发现果糖和可溶性淀粉同样能有效促进芽孢萌发，且效果均优于葡萄糖。 对于地衣芽孢杆菌CICC 20514 产芽孢碳源以果糖为最佳， 说明针对不同的目标产物， 所需最佳碳源种类有所不同。 本研究在镜检过程中还发现，以可溶性淀粉为碳源的发酵培养基部分菌体出现自溶现象，且后续进行重复试验时产芽孢数量不稳定，回收率差。 地衣芽孢杆菌不能直接利用可溶性淀粉为能量来源， 淀粉酶分解可溶性淀粉为单糖有益于微生物充分利用。 本研究中以可溶性淀粉为碳源的发酵培养基产芽孢性能不稳定，或许与地衣芽孢杆菌在发酵过程中产生淀粉酶的时间和数量有关，但具体原因有待进一步研究。

氮源是构成生物体蛋白质、核酸和其他含氮化合物的主要物质。 有研究表明有机氮源含有丰富的营养成分和未知的生长因子， 更能促进菌体的生长， 而无机氮源营养成分相对单一常常需要辅助多种营养物质才能达到较好的利用效果（陈志超等，2022）。 本试验仅对CICC 20514地衣芽孢杆菌进行了产芽孢培养基有机氮源的筛选， 结果显示花生饼粉和豆粕均具有良好的促芽孢生成效果， 原因可能是花生饼粉和豆粕富含多种氨基酸和维生素， 这些营养物质可作为生长因子， 对菌体的生长和芽孢的萌发有特殊的促进作用。Su 等（2019）研究表明，在优化解淀粉芽孢杆菌培养基过程中加入少量玉米粕、豆粕和麦麸有利于菌株的生长， 这些富含淀粉和蛋白质固体基质不仅是营养物质， 也是细菌增殖的载体，本研究结果与之相同。

无机盐是菌体生长繁殖过程中调节生理活性作用的物质， 主要功能包括构成菌体组成成分、作为酶的激活剂或抑制剂、调节培养基的pH和渗透压等， 其种类和含量对菌体生长和代谢产物的生成具有很大影响（严凌斌等，2020）。 本试 验 采 用K2HPO4、NaCl、MnSO4、MgSO4和CaCO3进行了产芽孢发酵培养基无机盐组成的研究，结果显示Na+、K+、Ca2+、Mg2+均对地衣芽孢杆菌产芽孢具有促进作用，梁栋等（2018）表示，Ca2+是影响芽孢数量的显著性因素， 常与芽孢核心成分2，6-吡啶二羧酸 （DPA） 形成螯合物Ca2+-DPA，促进芽孢萌发。 多篇文献报道，Mn2+有促进微生物生长和芽孢萌发的作用， 但在本研究中无明显效果， 可能是CICC 20514 地衣芽孢杆菌对Mn2+的需求和其他菌株不同 （杨旭等，2022；Ren 等，2018）。

除培养基组成影响微生物生长繁殖外，培养条件也是决定微生物是否能够高效生产目标产物的关键因素（余萍等，2021）。 本试验初步研究了接种量、初始pH、装样量和发酵终止时间对地衣芽孢杆菌CICC20514 产芽孢效果的影响，结果显示过多或过少的接种量均会影响发酵液产芽孢数量， 适当的接种量可以有效缩短发酵产芽孢周期。 装样量的改变通常代表溶氧浓度，装样量越少溶氧能力越强， 装样量过高则发酵液中的溶氧量不足，会影响菌体生长繁殖。 张璐璐等（2015）研究球孢白僵菌发酵工艺时使用250 mL锥形瓶进行试验，装样量20%为最佳，本研究以500 mL 锥形瓶研究装样量的影响， 也是20%为最佳。 培养基初始pH 的改变会影响微生物的生长和代谢，Singh 等（2022）研究表明，地衣芽孢杆菌AP1 在pH 6.5 时生物氢的产量最佳，过酸或过碱都会影响生产效果，CICC 20514 地衣芽孢杆菌在pH 过高或过低条件下产芽孢效果也有所减少，但在pH 6.5 ~ 7.5 产芽孢数量差异不明显，本研究配制的发酵液初始pH 基本维持在中性范围，可直接使用不需再进行调节。 不同的发酵终止时间对能否收获到足够数量的芽孢有着重要影响，本试验选择持续监测48 ~ 96 h 发酵液芽孢数量的变化， 发现在一定时间范围内芽孢数量不随培养时间的延长发生显著性变化，但当发酵时间过长时，数量有所下降。 通过镜检发现48 ~ 72 h 发酵液中大部分芽孢呈萌发状态，未完全脱落，84 ~ 92 h 发酵液芽孢开始脱落，成为单独的个体， 菌体因发酵液中代谢产物的大量积累出现自溶现象， 故选用48 h 作为发酵终止培养时间。

微生物生长繁殖是一个复杂的过程，其生长过程存在多种影响因素， 这些因素之间往往存在交互作用， 通过科学的方法对特定菌株的培养基和培养条件进行优化， 使目标产物达到最大值，不仅能节省成本，也能进一步研究各因素与目标产物之间的关系。 本试验仅对CICC 20514 地衣芽孢杆菌发酵产芽孢培养基和培养条件进行了单因素和正交试验的筛选， 下一步将针对不同因素之间交互作用影响进行深入研究，以优化达到更好的产芽孢条件，为相关菌剂产品的制作、生产与利用提供理论支撑。

4 结论

地衣芽孢杆菌CICC 20514 发酵产芽孢培养基最优搭配组合为20 g/L 果糖、20 g/L 豆粕、7 g/L NaCl、5 g/L K2HPO4、0.8 g/L CaCO3和0.8 g/L MgSO4，在37 ℃，220 r/min，接种量5%，装样量20%，发酵液初始pH 6.5~7.5 条件下，培养48 h，活菌数可达7.2×109CFU/mL，芽孢数达5.8×109CFU/mL，芽孢率达80%。 经重复试验，优化后的培养基产芽孢数及芽孢率均具有良好的的稳定性， 能满足饲用地衣芽孢杆菌制剂的研制需求。