酶解荷叶制备荷叶小分子多肽的研究

郝晓华， 刘可心

（忻州师范学院生物系，山西忻州 034300）

荷叶是睡莲科植物莲 （Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥叶。 对荷叶营养成分及其水提取物抗氧化活性研究表明，荷叶中氨基酸种类比较齐全，富含人体所必需的氨基酸，如亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸等，总氨基酸含量达133 g/kg（刘军波等，2015）。 而干荷叶粉中的蛋白质含量达到了22.9%（杨月欣，2013）。荷叶还含有生物碱、黄酮、多糖及多酚等功能性成分，有降脂减肥、抗炎抑菌、镇定安神抗疲劳的作用（王婵等，2020）。 另外，研究表明，荷叶的甲醇提取物有很强的抗氧化活性（纪丽莲等，2001），其抗氧化性与BHA 相当，略高于α–生育酚，可抑制约74%的亚麻酸氧化。 目前，对荷叶的研究仅限于加工、选育、成分分析等，对其功能成分的研究多集中于荷叶的生物碱、黄酮、多糖等（李伟民等，2020），局限于荷叶蛋白的优化提取。

小分子肽又称寡肽，一般由2 ～10 氨基酸组成，是蛋白质结构的功能片段。小分子肽具有易吸收、无抗原性、生物活性强等优于蛋白质的特点，具有更高的营养价值（丛峰松，2018）。

酶解法与其他制备多肽的方法相比较， 其具有高重复率、快捷、安全、可控等特点，因而被广泛使用。 碱性蛋白酶是pH 在9 ～11 下可以水解蛋白质肽键的酶，与其他蛋白酶进行比较，碱性蛋白酶可以催化生成高耐消化性、高抗氧化性、分子质量更小的抗氧化肽（阚旭辉等，2016）。 近年来，有很多以绿豆、大豆、玉米等为原材料制备多肽的研究（马瑞等，2019；任健等，2013；王梅等，2012）。这些更多作为粮食食用， 而荷叶一般用作中草药和观赏使用，与绿豆、大豆、玉米等相比，荷叶利用率较低。本文通过优化酶解荷叶制备小分子多肽，以更好地利用荷叶蛋白资源，提高荷叶的利用率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器 微型植物式样粉碎机； 电子天平；超声波细胞粉碎机；水浴恒温振荡器；低速离心机；电热鼓风干燥箱；酶标仪；紫外可见分光光度计；冷冻干燥机。

1.1.2 主要材料与试剂 荷叶： 淘宝松草堂旗舰店；氢氧化钠、无水乙醇、牛血清清蛋白、考马斯亮蓝（G-250）、85%磷酸、95%乙醇、CAS 9014-01-1碱性蛋白酶（2.0×105U/mg）：合肥千盛生物科技有限公司；BC 3185 双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒：索莱宝生化试剂盒事业部。所用试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 荷叶多肽的制备 参考尹佳等（2020）试验方法，制备荷叶小分子多肽。 先将干荷叶置于粉碎机中粉碎，再过80 目筛，得到荷叶粉。 称取2.0 g荷叶粉按照料液比1:20 加入蒸馏水40 mL，摇匀。 加入1 mol/L 的标准NaOH 溶液调节酸碱度，达到碱性蛋白酶的最适pH（9 ～11），再加入0.2 g的碱性蛋白酶，并在43 ℃和固定90 W 的超声波辅助条件下进行酶解，酶解90 min。 酶解完成后在沸水水浴85 ℃下灭酶25 min。 冷却至室温后，4000 r/min 离心25 min，取上清液，将上清液放入冷冻干燥机中干燥，然后放在冰箱冷藏室备用。

1.2.2 单因素试验设计 在酶加量5000 U/g 的条件下，设置底物浓度（酶与底物质量比值）、酶解温度、酶解时间、酶解pH 四个单因素，分别选底物浓度为2%、3%、4%、5%、6%， 酶解温度为45、50、55、60、65 ℃，酶解pH 为6、7、8、9、10，酶解时间为3、4、5、6、7 h 四个因素对上一步得到的荷叶多肽做单因素试验，每个试验重复三次。考察各因素对多肽浓度的影响，选取最佳酶解条件。

1.2.3 响应面试验设计 参考饶胜其等（2015）和孙菁茹等（2020）研究进行响应面试验。 根据单因素试验结果和Box-Benhnken 中心组合试验原理，以底物浓度、酶解温度、酶解pH、酶解时间四个因素为自变量， 多肽浓度为响应值。 利用Design Expert 10.0 软件， 每个因素设定5 个水平进行试验，且每个因素重复三次，作4 因素3 水平的因素水平编码表（表1）。 利用Design Expert 10.0软件，对回归模型进行分析，根据各参数两两之间的交互作用对多肽含量的影响， 作响应曲面3D图和等高线图。

表1 四因素三水平表

1.2.4 标准曲线的绘制 采用Bradford 法测定蛋白质的浓度，详情见表2。 准确称量0.100 g 牛血清清蛋白，用蒸馏水进行溶解，溶解后用蒸馏水定容至100 mL。 得到1 mg/mL 牛血清清蛋白标准溶液。 准确称量0.050 g 考马斯亮蓝G-250 溶于25 mL 95%乙醇中，加入50 mL 85%磷酸，用蒸馏水定容至500 mL，得到考马斯亮蓝试剂。 分别在7 支试管中加入0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mL 的牛血清清蛋白标准溶液， 分别用蒸馏水补齐至0.20 mL，再分别加入5.00 mL 的考马斯亮蓝试剂于7 支试管中， 混合均匀5 ～20 min后，在595 nm 处比色测定，并在Excel 中以标准蛋白含量为横坐标， 吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

表2 蛋白浓度测定

1.2.5 多肽浓度的测定 采用双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒， 分别将40 μL 蒸馏水和200 μL试剂一加入0.5 mL EP 管中， 混合均匀后在室温下静置15 min，取200 μL 于96 孔板，在540 nm下比色测定，将该EP 管作为空白管并记为A1。分别将40 μL 标准液和200 μL 试剂一加入0.5 mL EP 管中， 混合均匀后在室温下静置15 min，取200 μL 于96 孔板，在540 nm 下比色测定，将该EP 管作为标准管并记为A2。 分别将40 μL 待测液和200 μL 试剂一加入0.5 mL EP 管中，混合均匀后在室温下静置15 min， 取200 μL 于96 孔板，在540 nm 下比色测定，将该EP 管作为待测管并记为A3。 蛋白质浓度的计算公式如下：

式中：CA1为A1的多肽浓度，mg/mL；A1为空白管；A2为标准管；A3为待测管。

1.2.6 试验数据处理 采用Excel 软件做标准曲线和四个因素分别影响多肽含量的图， 采用Design Expert 10.0 软件对响应面数据进行方差分析， 得到多元二次响应面回归模型并根据各参数两两之间的交互作用对多肽含量的影响， 作响应曲面3D 图和等高线图。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制 以牛血清清蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，牛血清清蛋白标准曲线如图1 所示。回归方程为：y=8.1232x+0.024，R2=0.9979。

图1 蛋白质溶液标准曲线

2.2 单因素试验设计结果及分析

2.2.1 底物浓度对多肽含量的影响 根据图2 可知，底物浓度为2%时，多肽含量最小。 随着底物浓度的增加， 荷叶的多肽含量随着底物浓度的增加先增加，在底物浓度为4%时，多肽含量达到最高。 当底物浓度超过4%时，荷叶的多肽含量随着底物浓度的增加而降低。 有可能因为酶解产物的增多对酶有抑制作用， 并且加速酶促反应的逆反应，所以多肽含量越来越小。

图2 底物浓度对荷叶多肽含量的影响

2.2.2 酶解温度对多肽含量的影响 根据图3 可知，酶解温度为45 ℃时，多肽含量最小。随着酶解温度的增大， 荷叶的多肽含量随着酶解温度的增大先增大，在酶解温度为55 ℃时，多肽含量达到最高，当酶解温度超过55 ℃时，荷叶的多肽含量随着酶解温度的增加而降低。 因碱性蛋白酶的最适温度为40 ～55 ℃，当温度过低时，碱性蛋白酶活性比较低，但是还没有失活。由低温到最适温度的时间段里，酶的活性会随着温度的升高而升高，多肽含量也随之增大。但是当温度高于最适温度，酶活性会随着温度的升高而降低， 多肽含量也随之减少。 高于60 ℃时，碱性蛋白酶失活。

2.2.3 酶解pH 对多肽含量的影响 由图4 可知，酶解pH 为6 时，多肽含量最小，荷叶的多肽含量随着酶解pH 的增大先增大，在酶解pH 为9时，多肽含量达到最高，当酶解pH 超过9 时，酶活性降低，底物解离速度降低，荷叶的多肽含量随着酶解pH 的增加而降低。 当pH 小于最适酶解pH 时，酶的活性部位的基团没有完全解离，活性部位不能完全暴露， 酶促反应减慢， 多肽含量降低。 当pH 过高于或者过低于最适酶解pH 时，碱性蛋白酶的空间结构被破坏， 酶构象改变， 酶失活。

图4 酶解pH 对荷叶多肽含量的影响

2.2.4 酶解时间对多肽含量的影响 根据图5 可知，酶解时间为7 h 时，多肽含量最小。 荷叶的多肽含量随着酶解时间的增大是先增大， 在酶解时间为5 h 时，多肽含量达到最高。当酶解时间超过5 h 时， 荷叶的多肽含量随着酶解时间的增加而降低。 当酶解时间超过5 h 时， 由于长时间的酶解，产物增加，可能导致酶促反应的逆反应加剧，多肽含量也随之下降。

图5 酶解时间对荷叶多肽含量的影响

2.3 响应面试验设计结果及分析

2.3.1 响应面试验结果 以底物浓度、酶解温度、酶解pH、酶解时间四个因素为自变量，多肽浓度为响应值，进行响应面试验，确定碱性蛋白酶酶解荷叶制备多肽的最佳工艺条件。 响应面试验结果见表3。

表3 响应面试验结果

2.3.2 方差分析 通过Design Expert 10.0 软件对数据进行分析， 建立多元二次响应面回归模型为 ：R ＝8.95 ＋0.05A ＋0.019167B ＋0.1283C ＋0.04083D ＋0.01AB ＋0.015AC ＋0.02AD－0.0775BC ＋0.11BD ＋0.0275CD －0.85A2－0.40875B2－0.15C2－0.28125D2。 由表4 可知，模型F＝6.37，P ＜0.01,表明模型极显著， 失拟项F＝3.06，P ＝0.1465 （P ＞0.05）， 说明失拟项在上述回归模型中无显著性，该模型的R2＝0.8643，R2adj＝0.7285， 说明该模型与试验拟合度较好。 A2、B2表现为极显著（P ＜0.01），说明对响应值影响极大；D2表现为显著 （P ＜0.05），说明对响应值影响较大。 由F 检验可得影响因素排序为：酶解pH（C）＞底物浓度（A）＞酶解时间（D）＞酶解温度（B）。

表4 回归模型分析结果

2.3.3 响应面图形分析 响应面图直观反映了不同因素之间的交互作用对多肽浓度的影响。 两两因素交互作用是否显著与响应面图形相关， 响应面图形曲面越陡， 两因素交互作用对多肽浓度的影响越大；曲面越平滑，两因素交互作用对多肽浓度的影响越小。

观察图6（a）可看出，响应面图形陡，说明酶解温度和底物浓度的交互作用对多肽浓度影响显著。 图6（b）呈椭圆形，表明酶解温度和底物浓度交互作用对多肽浓度影响显著。

图6 酶解温度与底物浓度交互作用对荷叶多肽浓度影响的响应面图

观察图7（a）可看出，响应面图形陡，说明酶解pH 和底物浓度的交互作用对多肽浓度影响显著。图7（b）呈椭圆形，表明酶解pH 和底物浓度的交互作用对多肽浓度影响显著。

图7 酶解pH 与底物浓度交互作用对荷叶多肽浓度影响的响应面图

观察图8（a）可看出，响应面图形陡，说明酶解时间和底物浓度的交互作用对多肽浓度影响显著。 图8（b）呈椭圆形，表明酶解时间和底物浓度的交互作用对多肽浓度影响显著。

图8 酶解时间与底物浓度交互作用对荷叶多肽浓度影响的响应面图

图9（a）可看出，响应面图形不太陡，说明酶解pH 和酶解温度的交互作用对多肽浓度影响不显著。图9（b）呈近椭圆形，表明酶解pH 和酶解温度的交互作用对多肽浓度影响不显著。

图9 酶解pH 和酶解温度交互作用对荷叶多肽浓度影响的响应面图

观察图10（a）可看出，响应面图形不太陡，说明酶解时间和酶解温度的交互作用对多肽浓度影响不显著。 图10（b）呈近椭圆形，表明酶解时间和酶解温度的交互作用对多肽浓度影响不显著。

图10 酶解时间与酶解温度交互作用对荷叶多肽浓度影响的响应面图

观察图11（a）可看出，响应面图形不太陡，说明酶解时间和酶解pH 的交互作用对多肽浓度影响不显著。 图11（b）呈近椭圆形，表明酶解时间和酶解pH 的交互作用对多肽浓度影响不显著。

图11 酶解时间与酶解pH 交互作用对荷叶多肽浓度影响的响应面图

2.4 验证酶解荷叶制备小分子多肽的优化工艺采用Design Expert 10.0 软件做响应面优化试验，得到制备荷叶多肽的最佳工艺条件为： 底物浓度4.07%、酶解温度54.96 ℃、酶解pH 8.88、酶解时间5.19 h，在上述条件下，多肽浓度为8.98093 mg/mL。

3 结论

本试验为优化利用荷叶蛋白资源， 提高荷叶的利用率， 利用超声波辅助碱性蛋白酶酶解荷叶制备荷叶小分子多肽，再经过以底物浓度、酶解温度、酶解pH、酶解时间四个单因素为自变量做单因素试验。然后在单因素试验结果的基础上，进行响应面优化试验， 响应面优化后得到的最佳酶解条件经过验证， 得到荷叶多肽制备的最佳条件为底物浓度4.07%、 酶解温度54.96 ℃、 酶解pH 8.88、酶解时间5.19 h。 在该条件下，多肽浓度为8.98×10-3mg/mL。 还得知影响多肽浓度的因素排序为：酶解pH＞底物浓度＞酶解时间＞酶解温度。