产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种ZW18益生基因分析

李欣媛，杨凤妍，吕厚姣，耿伟涛，王艳萍*

（天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457）

益生菌是一类达到一定数量时能够维持人体肠道菌群平衡，保护宿主健康的活性微生物[1-3]。乳酸菌在益生菌中扮演着重要角色，它们能够利用碳水化合物产生乳酸[4]，有助于蛋白质和钙的吸收，从而预防疾病[5]。1857年，法国微生物学家LOUIS PASTEUR首次发现乳酸菌，这标志着乳酸菌的出现[6]。之后越来越多的科学家开始专注研究乳酸菌，以期能够为人类带来更好的健康效果。产马乳酒乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）属于乳杆菌科（Lactobacteriaceae），乳杆菌属（Lactobacillus），呈长杆状的革兰氏阳性菌[7]，包含两个亚种，其中产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种于2021年被国家卫健委列为国家新食品原料[8]，该亚种兼性厌氧且具有高产胞外多糖的生物学特性及抗氧化、抗肿瘤、抗过敏、改善肠道健康、免疫调节等益生功能，具有潜在应用价值[9]。此前，本实验室对西藏开菲尔粒的微生态组成进行了多年研究，并从中分离出多株产马乳酒乳杆菌，前期已经发现其中产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciens）ZW3可以黏附在小鼠肠道上并产生有益菌群[10]，通过脑肠轴调节色氨酸代谢缓解小鼠抑郁[11]。前期研究还发现，Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciensZW18有很好的免疫调节能力等益生特性。随着检测技术的发展，基因组测序为全面系统地认识乳酸菌提供了方便[12]，并为预测乳酸菌的功能提供帮助[13-14]。

为了深入研究该种属菌的特性及差异性，本研究对产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciens）ZW18的全基因组进行测序和分析，与亲缘菌株进行比较，并且发掘益生作用的相关基因，为其深入研究和进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciens）ZW18：保藏于天津科技大学食品科学与工程学院发酵食品与微生物资源开发研究室，美国国立生物技术信息中心（national venter for biotechnology information，NCBI）登录号为CP123735。

产马乳酒乳杆菌高加索酸奶粒亚种（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefirgranum）、产马乳酒乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）等57株乳杆菌的全基因组序列均下载于NCBI的GenBank数据库。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基：牛肉膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，氯化钠5.0 g，柠檬酸氢二胺2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，吐温-80 1.0 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 6.2～6.4。115 ℃高压蒸汽灭菌15 min。MRS固体培养基在MRS液体培养基中加入2%琼脂粉。

1.1.3 试剂

液氮：天津市军粮城常福气体有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Anaerobox Ⅳ厌氧培养箱：美国GeneScience公司；3-18K冷冻离心机：德国SIGMA公司；Nanopore测序仪：牛津纳米孔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株ZW18的活化与培养

挑取-80 ℃冰箱冻存管的菌株ZW18于MRS固体培养基平板上划线，37 ℃厌氧培养活化，至菌落长出；挑取单菌落于MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养，以2%（V/V）接种量接种于新鲜MRS液体培养基中培养至对数生长期，室温下14 000 r/min离心1 min，菌体沉淀于液氮中速冻后转移至-80 ℃储存以供后续测序。

1.3.2 全基因组测序

将样品交由北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序。细菌基因组完成图基于Illumina二代测序以及Oxford Nanopore三代测序平台实现完整组装，获得全面的基因组信息。

1.3.3 生物信息分析

通过软件Prodigal v2.6.3[15]进行基因预测；采用软件Infernal v1.1.3[16]预测基因组中的三类核糖体核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）；采用tRNAscan-SE v2.0[17]高精确预测基因组中的转运核糖核酸（transfer RNA，tRNA）；采用CRISPR Recognition Tool对基因组进行CRISPR预测；采用软件BPGA构建系统进化树；利用在线注释软件Ortho Venn 2（https：//orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home）分析核心基因组、独特基因。使用基本局部比对搜索工具（basic local comparison search tool，BLAST）将预测得到的编码基因蛋白序列与公共蛋白数据库进行比对，如基因本体（gene ontology，GO）、基因的进化谱系：非监督直系群数据库（evolutionary genealogy of genes：non-supervised orthologous groups database，eggNOG）、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）等，获得编码基因的功能信息；采用在线注释网站RAST（https：//rast.nmpdr.org/）进行全基因组功能基因注释。使用Circos v0.66[18]完成全基因组精细圈图的绘制。

2 结果与分析

2.1 菌株ZW18基因组基本特征

为了更加全面直观的描述菌株ZW18基本特征，通过软件Circos v0.66制作基因组圈图，结果见图1。

图1 产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种ZW18基因组圈图Fig.1 Genome diagram of Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciens

由图1可知，经全基因组测序和组装，菌株ZW18基因组共有一个完整闭合的染色体和两个质粒，全长为2 438 418 bp，鸟嘌呤（guanine，G）胞嘧啶（cytosine，C）含量为37.27%。菌株ZW18中编码tRNA基因64个，rRNA基因12个，共预测到11个潜在CRISPR序列，其中9个分布在染色体中，2个在质粒2中。菌株ZW18在GO、eggNOG和KEGG数据库注释结果统计见图2。由图2A可知，通过GO数据库共注释到的基因个数为1 843个，其中与细胞膜构建、参与催化反应及代谢相关基因占比最多；由图2B可知，通过eggNOG数据库注释可得关于细胞复制、重组和修复基因数量最多，其次为碳水化合物的利用与一般功能预测相关基因，分别为273个、175个、162个；由图2C可知，通过KEGG数据库注释，菌株ZW18中ABC转运蛋白数量最多，能够把代谢物、药物和各种毒素从细胞中转运出来，维持细胞稳态。

图2 GO数据库（A）、eggNOG数据库（B）、KEGG数据库（C）基因注释统计结果Fig.2 Statistical results of gene annotation in GO database (A),eggNOG database (B), and KEGG database (C)

2.2 全基因组比较分析

2.2.1 系统发育树分析

为了确定近缘菌株，根据核心基因序列，利用基因组比较平台BPGA对菌株ZW18及其他57株乳杆菌进行系统发育树的构建，结果见图3。由图3可知，菌株ZW18与产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种ZW3、产马乳酒乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）ATCC 43761、产马乳酒乳杆菌高加索酸奶粒亚种（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefirgranum）DSM 10550及产马乳酒乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）1207遗传距离最近。除此之外与其较近的还有瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）与嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。

图3 基于核心基因序列构建菌株ZW18的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain ZW18 constructed based on the core gene sequences

2.2.2 核心基因组与独特基因分析

利用在线注释软件OrthoVenn2选取与菌株ZW18遗传距离较近的产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种ZW3、产马乳酒乳杆菌ATCC 43761、产马乳酒乳杆菌高加索酸奶粒亚种DSM 10550及产马乳酒乳杆菌1207进行全基因组序列比对，结果见图4。核心基因组指在所有个体中都存在的基因且非常保守。由图4可知，这5株产马乳酒乳杆菌共有的核心基因家族为1 553个。菌株ZW18的独特基因数量最多，有30个，说明菌株ZW18更具有多样性，有更多研究价值。

图4 核心基因组和独特基因Venn图Fig.4 Venn diagram of core genome and specific genes

2.3 益生功能相关基因分析

2.3.1 与应激反应相关基因分析

在菌株ZW18中共注释出19种与应激反应相关的基因，具体结果见表1。

表1 菌株ZW18中与应激反应相关主要基因分析结果Table 1 Analysis results of major genes related to stress response in strain ZW18

由表1可知，菌株ZW18中与氧化应激相关的基因有12种。烷基过氧化氢还原酶（alkyl hydroperoxide reductase）是分布在原核生物和真核生物中的一大家族硫醇特异性抗氧化蛋白的关键成分[19]。非特异性脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）结合蛋白Dps属于铁蛋白超家族，通过氧化和储存铁可以有效去除H2O2和Fe2+的毒性，保护DNA、蛋白质和膜脂免受自由基损害[20]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）过氧化物酶能够使菌株抵抗过氧化氢等的毒性，保护细胞生长[21]。Sir2蛋白在维持细胞抗胁迫能力、基因组稳定性等方面起重要作用[22]。除抵抗氧化应激外，菌株ZW18中还含有6种热休克、1种冷休克相关蛋白基因，帮助菌体抵御外界环境不良刺激。

2.3.2 与胃肠道耐受相关基因分析

人体胃肠道（gastrointestinal tract，GIT）具有许多防御机制来阻止病原体定植，包括胃酸和肠液，在保护机体、抵抗病原菌侵染方面起重要作用，同时也是考验益生菌能否在肠道中起作用的关键[23]。因此，对菌株ZW18基因组中与胃肠应激耐受性相关基因进行挖掘，结果见表2。由表2可知，菌株ZW18基因组中含有大量有助于细菌耐酸、耐胆盐的基因，表明该菌株有能力对胃肠道中的应激做出反应。F（1）F（0）-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成酶（F（1）F（0）-ATP synthetase）是重要的耐酸相关酶，活性随环境pH降低而增加。当pH下降时，F（1）F（0）-ATP合成酶会利用水解ATP的方式将H+从细胞内泵出以保持pH的平衡，同时保证细胞内正常代谢，从而在较低的pH环境下继续生长并产生有益的物质[24]。Na+/H+逆向转运蛋白在维持细胞pH稳态和Na+动态平衡中起重要作用，利用该Na+外排系统能够将多余Na+排至胞外从而维持细胞内外渗透压平衡[25]。在菌株ZW18中也发现了两个胆酰甘氨酸水解酶基因和两个胆盐转运蛋白基因。胆酰甘氨酸水解酶是一种胆盐水解酶，具有去交联胆盐的能力，被认为具有解除胆盐毒性的作用，延长菌体在肠道中的生存时间[26]。

表2 菌株ZW18中与胃肠应激耐受性相关基因分析结果Table 2 Analysis results of genes related to gastrointestinal stress tolerance in strain ZW18

2.3.3 与黏附和聚集相关蛋白质基因分析

益生菌对肠上皮细胞的黏附能力是其发挥益生作用的首要标准，黏附能力强的菌株更容易在肠道中停留，同时竞争性地排除有害病原体[27]。菌株ZW18基因组中与黏附和聚集相关的多种蛋白基因预测结果见表3。由表3可知，ZW18基因组中预测出7种与黏附和聚集相关的蛋白质基因。烯醇化酶在多种细菌表面上普遍存在，能够有效促进细菌与宿主之间的结合，增强细菌黏附力[28]；纤维连接蛋白结合蛋白是一种重要的多结构域糖蛋白，具有多种黏附特性[29]；S-层蛋白存在于乳杆菌中，能够增强菌株黏附力，抵御致病菌入侵宿主[30]；LPxTG细胞壁锚定结构域蛋白可以增加菌株黏附率，在一定程度上可以引起免疫细胞的响应，进而调节肠道炎症[31]。

2.3.4 与免疫相关特性基因分析

益生菌由于其黏附特性和竞争性抑制病原菌的能力使得肠道内含有大量益生菌群，对营养物质的摄入、疾病治疗等具有调节作用[32]。前期研究发现，菌株ZW18中具有多种黏附蛋白、细菌素和抵抗应激反应的基因。这些益生基因能够帮助菌株定植于肠上皮细胞，抑制病原菌，对人体肠道进行免疫调节[33]。除此之外，菌株ZW18基因组中预测出胞外蛋白基因（GE001482、GE002271）。据文献报道，这些基因可以辅助肠上皮细胞与免疫细胞相互作用，促进细胞因子的分泌[34]。前期研究也发现，菌株ZW18具有免疫辅助治疗小鼠黑色素瘤的效果[35]。

2.3.5 与细菌素相关特性基因分析

细菌素是细菌在代谢过程中分泌的一种小分子抗菌肽，对其自身往往无抑制作用，却能够抑制其他相近种属菌株生长[36]。细菌素无毒且抑菌作用强，是胃肠道中抑制病原菌的关键物质，可作为抗菌材料，具有较好的开发利用价值。因此，对菌株ZW18基因组中与细菌素相关特性基因进行分析，结果见表4。由表4可知，菌株ZW18中共预测出5种与细菌素相关的基因，包括羊毛硫细菌素Class-Ⅳ、肠菌素A、瑞士乳杆菌素J同源物及细菌素免疫蛋白，其中，羊毛硫细菌素Class-Ⅳ数量最多，共69个。

2.4 菌株ZW18合成营养物质相关基因分析

益生菌的营养合成（维生素和必需氨基酸）正成为新型发酵食品的一个研究热点。维生素是人体生理反应中重要的微量营养素，维生素缺乏会增加患传染病、过敏性疾病和炎症性疾病的风险[37]。对菌株ZW18基因组中与维生素合成的相关基因进行预测，结果见表5。由表5可知，在菌株ZW18基因组中预测到34种与维生素合成相关的基因，分别与硫胺素、核黄素、吡哆醇、生物素和叶酸合成有关。

表5 菌株ZW18中与合成维生素相关基因分析结果Table 5 Analysis results of genes related to synthetic vitamins in strain ZW18

人体需要从食物中摄取的8种必需氨基酸为异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸[38]，而半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸是对婴儿和正在成长中的儿童很重要的4种氨基酸[39]。对菌株ZW18基因组中与合成氨基酸相关的基因进行预测，结果见表6。由表6可知，从菌株ZW18基因组中共预测到24种与氨基酸合成相关的基因，分别与精氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸生物合成有关。

表6 菌株ZW18中与合成氨基酸相关基因分析结果Table 6 Analysis results of genes related to synthetic amino acids in strain ZW18

3 结论

通过对产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种ZW18进行全基因组测序可得其基因组中共有一个完整闭合的染色体和两个质粒，全长为2 438 418 bp，GC含量为37.27%。通过数据库注释可知其生长稳定且对碳水化合物利用基因较多。菌株ZW18有1 553个核心基因，30个独特基因，是产马乳酒乳杆菌中具有多样性的菌株。菌株ZW18中含有很多益生相关基因，在抵抗恶劣环境胁迫、抗氧化、耐受胃肠道、调节免疫、抗菌等方面有突出作用。除此之外，该菌株能够合成人体所需维生素，如硫胺素、核黄素等，也可以合成成人及婴幼儿生长所需氨基酸，如赖氨酸、蛋氨酸等，具有潜在研究价值。综上，从产马乳酒乳杆菌马乳酒亚种ZW18的全基因组分析及功能特性可以看出，菌株ZW18是一株益生功能强且具有潜在应用价值的菌株，为其今后的进一步深入研究与应用提供了基础数据。