越橘原花青素的提取及其体外抗氧化活性研究

周春晖，龚丽妍，丘智聪，王伟廷，范 瑞

（广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广东 广州 510030）

越橘（Vɑccinium vitis-idɑeɑLinn.）原产于欧洲大陆北部和北美洲北部森林，在我国的吉林、内蒙古、新疆、黑龙江等地区也有分布。越橘中含有原花青素、花青素、有机酸及多酚类、黄酮醇类物质等多种营养成分[1-4]，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、改善肝功能和降血糖等功能[5-9]。原花青素作为越橘的主要功效成分，是一种具有独特分子结构的生物类黄酮物质[10]，在抗氧化、降血脂、降血压、抗糖尿病及促进和活化视网膜的视红素再合成等功能上均具有显著作用[11-15]。

原花青素的提取方法有溶剂提取法[16]、酶解提取法[17]、超临界CO2提取法[18-19]、超声波辅助提取法[20]、微波辅助提取法[21]等。酶解提取法可以更好地溶出生物活性物质，提高得率[22]。王海波等[23]使用双酶（纤维素酶-果胶酶）提取葡萄皮渣中的原花青素，经过优化工艺条件后提取的原花青素含量达22.914 mg/g。超声波辅助提取法可加速破坏植物细胞壁，迅速溶出细胞内容物，能大幅缩短提取时间，提高提取率。邢颖等[24]以板栗为原材料，采用超声波辅助纤维素酶法提取原花青素，提取量为21.03 mg/g，高于单独用酶解法的提取量（10.12 mg/g）。本文以越橘为原料，采用超声波辅助双酶酶解法提取越橘中原花青素，响应面优化试验获得原花青素的最佳提取条件，同时对提取物的体外抗氧化活性进行研究，以期为越橘功效成分的提取及后续功能性食品的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

越橘干果：由乌鲁木齐新边界贸易有限公司提供。

盐酸、正丁醇、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、抗坏血酸、硫酸亚铁、水杨酸、氢氧化钠（粒）、无水乙醇、硫酸铁铵（NH4Fe(SO4)2·12H2O）：均为分析纯，广州市海珠化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；原花青素标准品（UV＞98%）：安徽酷尔生物工程有限公司；纤维素酶（10 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；果胶酶（10 000 U/g）：宁夏和氏壁生物技术有限公司。

1.1.2 仪器与设备

pH-100 型笔式酸度计：上海力辰邦西仪器科技有限公司；101-3AB型电热鼓风干燥箱、FW177型中草药粉碎机、DK-98-IIA 型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；JY96-IIN 型超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；SC-3610型高容量低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-5200型紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 越橘的预处理及原花青素的提取

越橘预处理：将越橘干果置于60 ℃的电热鼓风干燥箱中处理4 h，然后进行粉碎并过80 目筛，越橘粉置于干燥器中密封备用。

原花青素提取：称量越橘粉1.00 g，加入一定比例的纤维素酶和果胶酶，加去离子水，调节pH，置于55 ℃恒温水浴锅中酶解，灭酶，加入体积分数60%乙醇溶液进行超声波提取（功率120 W，提取2 s，间歇4 s，60 ℃），然后以5 000 r/min 离心20 min，取上清液，干燥，得到越橘原花青素粗提物。

1.2.2 越橘原花青素提取的单因素试验设计

选择料液比、酶解pH、酶解时间、纤维素酶与果胶酶的质量比（酶的总添加量保持质量分数0.2%不变）、超声时间为影响因素，以越橘原花青素得率为考察指标设计单因素试验，研究其对越橘原花青素提取得率的影响。各单因素的条件和范围设置如下：酶解pH 5.0，酶解时间90 min，纤维素酶与果胶酶的质量比1∶1，超声波时间30 min，液料比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）；酶解pH 5.0，料液比1∶25（g/mL），酶解时间90 min，超声时间30 min，纤维素酶与果胶酶的质量比分别为1.0∶0.6、1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2、1.0∶1.4；料液比1∶25（g/mL），酶解时间90 min，纤维素酶与果胶酶的质量比1∶1.2，超声时间30 min，酶解pH 分别为3.0、4.0、5.0、6.0 和7.0；酶解pH 5.0，料液比1∶25（g/mL），纤维素酶与果胶酶的质量比1∶1.2，超声时间30 min，酶解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h；酶解pH 5，料液比1∶25（g/mL），酶解时间90 min，纤维素酶与果胶酶的质量比为1∶1.2，超声时间分别为20、30、40、50、60 min。

1.2.3 越橘原花青素提取的响应面优化试验设计

基于响应面中心组合试验的设计原则和单因素试验结果的方差分析，挑选出影响越橘原花青得率的显著因素，分别为料液比、酶解pH值和超声波提取时间，以这3 个显著因素为响应面优化因素，以越橘原花青素得率为响应值，采用Design-Expert 10 软件设计响应面试验的因素和水平，具体见表1。

表1 越橘原花青素提取工艺响应面优化试验因素水平设计Table 1 Response surface optimization experimental factor level design for bilberry proanthocyanidin extraction technique

1.2.4 越橘原花青素提取得率的测定

1.2.4.1 原花青素标准曲线的绘制

准确称量原花青素标准品10.0 mg，用无水乙醇溶解并定容至10 mL，分别吸取0、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL 该溶液于10 mL 容量瓶中，加入乙醇至刻度线，摇匀，分别移取1 mL 不同浓度溶液至10 mL容量瓶中，并加入6 mL 盐酸-正丁醇（5∶95）溶液、0.2 mL硫酸铁铵溶液，混合均匀，置于沸水中40 min，然后立即在冰水中冷却至常温，于546 nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，原花青素质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程。

1.2.4.2 越橘原花青素的测定

取越橘原花青素提取液移至具塞容量瓶中，60%乙醇定容至刻度线，吸取1 mL 样液于10 mL 具塞比色管中，精密加入盐酸-正丁醇（5∶95）溶液6 mL，硫酸铁铵溶液0.2 mL，混合均匀并密封，置沸水中加热40 min 后取出，立即置冰水中冷却至室温，测定其吸光度，根据标准曲线计算原花青素质量浓度。越橘原花青素得率的计算公式如下：

式中：c为越橘原花青素的质量浓度，µg/mL；V为提取越橘原花青素的上清液体积，mL；n为提取液稀释倍数；m为越橘粉的质量，g。

1.2.5 越橘原花青素提取液体外抗氧化活性的测定

1.2.5.1 羟基自由基（·OH）清除能力

参考宋昱等[25]和张镜等[26]的方法，并加以改进。向5 支比色管中依次加入1 mL 质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L 的越橘原花青素粗提物溶液，然后分别加入1.0 mL 9 mmol/L 的硫酸亚铁、1.0 mL 9 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液、1.0 mL 8.8 mmol/L 的过氧化氢溶液，37 ℃恒温水浴30 min，510 nm测定其吸光度，同时以同质量浓度的VC为对照。·OH清除率的计算公式如下：

式中：A1为加入蒸馏水代替越橘原花青素粗提物溶液的空白对照液的吸光度；A2为加入越橘原花青素粗提物溶液的吸光度；A3为用蒸馏水代替显色剂（过氧化氢）的吸光度。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力

参照王晗等[27]的方法并加以改进。称取0.05 g的DPPH，用500 mL 无水乙醇溶解，定容于棕色容量瓶中，配成0.1 mmol/L 的DPPH 溶液，为防止紫外线照射，放置阴暗处备用。另取抗坏血酸，用无水乙醇进行溶解，配制成质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的溶液，分别取配制好的不同质量浓度的样品溶液1 mL，置于10 mL 试管中，加入3 mL DPPH 溶液，30 ℃条件下避光反应30 min，于517 nm处测其吸光度，同样方法测抗坏血酸梯度溶液的吸光度，同时以同质量浓度的VC为对照。DPPH自由基清除率的计算公式如下：

式中：As′为1.0 mL 样品溶液+3.0 mL 无水乙醇的吸光度；As为1.0 mL 无水乙醇+3.0 mL DPPH 溶液的吸光度；A′为1.0 mL 样品溶液+3.0 mL DPPH 溶液的吸光度。

1.2.5.3 超氧阴离子自由基（O-2·）清除能力

参照金宁等[28]的方法并加以改进。向20 mL 试管中添加9 mL pH 8.2 的Tris-HCl 缓冲液，于25 ℃下恒温水浴20 min，向试管中加入40 mL邻苯三酚溶液（45 mmol/L 邻苯三酚，10 mmol/L HCl），25 ℃中预热后立即混合并倒入1 cm的比色皿中，添加9 mL Tris-HCl缓冲液作为对照，在25 ℃下每隔30 s测定325 nm处的吸光度，自氧化速率控制在0.06/min，邻苯三酚自氧化3 min后，迅速加入1滴VC，立即混合，室温静置5 min后，测定吸光度，即A0。在上述Tris-HCl缓冲液中，预先分别加入质量浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的原花青素粗提物溶液1.0 mL，再按上述方法测定邻苯三酚自氧化体系的吸光度As和空白试剂吸光度As′，同时以同质量浓度的VC 为对照。O-2·清除率的计算公式如下：

式中：A0为加入原花青素样品后的邻苯三酚自氧化速率吸光度；As为邻苯三酚自氧化速率吸光度；As′为蒸馏水作为空白试剂的吸光度。

1.2.6 数据处理

响应面试验数据使用Design-Expert 10 软件处理，其他数据使用Excel 2019软件处理。

2 结果与分析

2.1 原花青素标准曲线的绘制

以原花青素标准溶液的吸光度值为纵坐标，原花青素标准溶液的质量浓度为横坐标，绘制准曲线，结果如图1所示。原花青素标准曲线回归方程为：y=0.002 5x+0.004 6，R2=0.998 9。

图1 原花青素溶液的标准曲线Fig.1 Standard curve of proanthocyanidin solution

2.2 越橘原花青素提取单因素试验结果

2.2.1 料液比对越橘原花青素得率的影响

如图2 所示，随着溶剂的增多，越橘原花青素得率呈先升高后降低的趋势。当料液比为1∶25（g/mL）时，原花青素得率达到最高；当料液比为1∶30（g/mL）时，得率反而降低，可能是因为料液比为1∶25（g/mL）时，越橘粉中的原花青素已经全部溶出，继续增加提取溶剂的用量，使超声波破碎细胞的程度下降，提取的有效成分减少，得率也随之降低。

图2 料液比对越橘原花青素得率的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.2.2 纤维素酶与果胶酶的质量比对越橘原花青素得率的影响

如图3所示，纤维素酶与果胶酶的质量比在1.0∶0.6～1.0∶1.2 范围内得率呈缓慢上升趋势，且变化较小。原因可能是，当酶的总用量不变时，随着果胶酶占比的增加，酶对越橘粉细胞壁的降解作用增加，将更多的原花青素释放到溶剂中[29]，从而使得原花青素得率逐渐提高。当纤维素酶与果胶酶的质量比为1.0∶1.2时，得率达到最大值；当纤维素酶与果胶酶的质量比为1.0∶1.4时，得率缓慢下降，可能是因为在纤维素酶与果胶酶的质量比为1.0∶1.2时，纤维素酶和果胶酶已使越橘粉中的原花青素最大限度地溶出，该条件下两种酶发挥的作用最大，达到比较高的得率，若果胶酶占比再增大，两种酶的复合作用会减弱，得率随之下降。由此可得，纤维素酶与果胶酶的最佳质量比为1.0∶1.2。

图3 纤维素酶与果胶酶的质量比对越橘原花青素得率的影响Fig.3 Effect of mass ratio of cellulase to pectinase on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.2.3 酶解pH对越橘原花青素得率的影响

如图4所示，酶解pH为3.0、4.0、5.0时，随着酶解pH的升高，越橘原花青素得率大幅提高，当pH为5.0时，得率达到最大，可能是因为少量酸可以打开氢键和疏水键，以及蛋白质多糖和原花青素相互连接，以形成更多的游离多酚类物质和原花青素；酸可以抑制酚类物质与金属离子之间的沉淀反应，从而提高原花青素得率。pH太低，原花青素的溶解度会降低，得率降低，可能是因为原花青素含有多个羟基，一般呈弱酸性，易溶于碱性溶液，酸度过低会降低其溶解度[30]。当酶解pH大于5.0时，越橘原花青素得率呈下降趋势，可能是pH过高时会造成酶失活，使得越橘粉细胞壁酶解不够完全，造成得率下降。因此，确定酶解的适宜pH为5.0。

图4 酶解pH对越橘原花青素得率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis pH on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.2.4 酶解时间对越橘原花青素得率的影响

如图5 所示，酶解时间在0.5～1.5 h 时，越橘原花青素得率一直在升高，当酶解时间达到1.5 h时，得率达到最大值。原因可能是：酶解时间为0.5 h时，还有较多的底物未被酶解，酶与底物反应不完全，溶出的原花青素不多，因此得率较低；酶解时间为1.0 h 时，随着酶解时间的延长，酶与底物接触机会越大，溶出的原花青素逐渐变多，故得率升高，此时酶与底物的反应还不够完全；酶解时间继续延长至1.5 h时，酶与底物反应完全，基本溶出了底物的全部原花青素，所以得率达到最大值。当酶解时间大于1.5 h 时，得率开始下降，可能是因为随着酶解时间的延长，原花青素的稳定性不断下降，导致了得率逐渐降低。综合考虑时间成本与能源消耗，确定酶解的适宜时间为1.5 h。

图5 酶解时间对越橘原花青素得率的影响Fig.5 Effect of enzymolysis time on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.2.5 超声时间对越橘原花青素得率的影响

如图6 所示，超声时间为20～50 min 时，越橘原花青素的得率随着超声时间的延长而逐渐升高；超声时间为50 min 时，原花青素得率达到最大值，可能是随着超声时间的延长，超声波对越橘细胞组织不断地破坏，使原花青素不断溶出，得率不断升高，此时原花青素基本上已经提取完全，得率也达到了最大值9.27%；当超声时间大于50 min 时，得率反而下降，可能是继续延长超声时间，原花青素的结构被破坏导致。由此可得，超声波处理的适宜时间为50 min。

图6 超声时间对越橘原花青素得率的影响Fig.6 Effect of ultrasound time on the yield of bilberry proanthocyanidins

2.3 越橘原花青素提取响应面优化试验结果

2.3.1 响应面优化试验结果

在单因素试验结果的基础上进行响应面优化试验，试验结果见表2，方差分析见表3。对表2中的数据进行多元回归分析，得到各因素与越橘原花青素得率（Y）的二次多项式方程为：Y＝9.29＋0.26A－0.082B-0.21C＋0.13AB＋0.27AC－0.22BC－0.29A2-0.36B2-0.47C2。

表2 响应面优化试验设计和结果Table 2 Response surface optimization experimental design and results

由表3可知，各因素对越橘原花青素得率的影响大小排序为：A（料液比）＞C（超声时间）＞B（酶解pH）。其中，一次项A和二次项B2、C2对越橘原花青素得率的影响均达极显著水平（P＜0.01），一次项C、交互项AC、二次项A2对越橘原花青素得率的影响均达显著水平（P＜0.05）。回归模型的P值为0.002 9，失拟项不显著（P=0.1710＞0.05），表明拟合获得的模型方程极显著，回归模型与试验拟合良好，得出的越橘原花青素得率是可靠、有意义的。

2.3.2 各因素交互作用分析

利用Design-Expert 10软件绘制了各因素之间两两交互作用的响应面图和等高线图，具体见图7。料液比与超声时间的交互作用响应面图陡峭，且等高线图呈椭圆形，说明因素A与因素C的交互作用对越橘原花青素得率的影响显著，这与方差分析的结果一致。

图7 各因素交互作用对越橘原花青素得率影响的响应面图及等高线图Fig.7 Response surface and contour plots of the effect of interaction of the various factors on the yield of bilberry proanthocyanidins

对回归模型进行分析，得到越橘原花青素提取的最佳条件：料液比为1∶29.186（g/mL），酶解pH 为4.882，超声时间为51.563 min，在此条件下，越橘原花青素得率最高，为9.36%。为了方便操作，将提取条件调整为：料液比1∶30（g/mL），酶解pH为5.0，超声时间50 min。经验证试验得出，越橘原花青素的得率平均值为9.38%，与预测值偏差较小，说明此工艺优化具有一定的可靠性。

2.4 越橘原花青素体外抗氧化活性测定结果

2.4.1 羟基自由基清除能力

如图8 所示，随着质量浓度的增大，越橘原花青素粗提物溶液和抗坏血酸对·OH清除率均呈不断上升趋势。越橘原花青素质量浓度高于0.8 mg/L 时，其对·OH 的清除能力趋于平缓，清除率最高达97.84%，而抗坏血酸最高仅81.49%，明显低于越橘原花青素，二者的半数抑制浓度IC50分别为0.354 mg/L和0.642 mg/L，抗坏血酸高于越橘原花青素。因此，越橘原花青素和抗坏血酸对羟基自由基都有较强的清除能力，且与质量浓度有一定的量效关系，前者的清除能力强于后者。

图8 越橘原花青素和抗坏血酸对羟基自由基的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of bilberry proanthocyanidins and ascorbic acid against hydroxyl radicals

2.4.2 DPPH自由基清除能力

如图9 所示，随着质量浓度的增大，越橘原花青素粗提物溶液和抗坏血酸对DPPH 自由基的清除率均不断上升。越橘原花青素和抗坏血酸对DPPH 自由基都有较强的清除能力，与质量浓度有一定的量效关系。越橘原花青素提取液质量浓度高于0.8 mg/L后，对DPPH 自由基清除能力上升缓慢，清除率最高达到96.47%，而抗坏血酸最高只有82.06%，明显高于抗坏血酸，半数抑制浓度IC50分别为0.394 mg/L 和0.705 mg/L。因此，越橘原花青素有很强的DPPH 自由基清除能力。

图9 越橘原花青素和抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力Fig.9 Scavenging capacity of bilberry proanthocyanidins and ascorbic acid against DPPH free radicals

2.4.3 超氧阴离子自由基清除能力

如图10所示，随着质量浓度的增大，越橘原花青素粗提物溶液和抗坏血酸对O-2·的清除率均不断上升，且与质量浓度有一定的量效关系。二者对O-2·的清除率最高分别为94.47%和87.06%，半数抑制浓度IC50分别为0.387 mg/L和0.720 mg/L。因此，越橘原花青素有较强的O-2·清除能力。

图10 越橘原花青素提取液和抗坏血酸对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.10 Scavenging capacity of bilberry proanthocyanidin and ascorbic acid against superoxide anion free radicals

3 结论

本研究对越橘原花青素的提取工艺进行了优化，并对其体外抗氧化活性进行了研究。结果表明：以越橘干果为原料，经60 ℃干燥4 h 后粉碎过筛（80目）得越橘粉，在料液比1∶30（g/mL），纤维素酶与果胶酶质量比为1∶1.2，酶解pH 5.0，酶解时间90 min，超声时间50 min条件下，越橘原花青素得率最高，达9.38%。越橘原花青素对羟基自由基、DPPH 自由基和超氧阴离子自由基的清除率最高分别为97.84%、96.47%和94.47%，半数抑制浓度IC50分别为0.354、0.394、0.387 mg/L。这表明本试验制备的越橘原花青素具有较好的抗氧化活性。该研究为越橘的精深加工和以原花青素为功效成分在医学、食品等领域的产品开发提供了理论依据和技术参数，具有一定的参考价值，后期可对以越橘为主要原料的功能性食品的创新开发进行更深入的研究与探讨。