基于微卫星标记的密点麻蜥遗传结构分析

范译心，申志坤，邓文卓，李 铀,2

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124；2.西北民族大学生物医学研究中心，甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030）

密点麻蜥（Eremias multiocellata）属蜥蜴科麻蜥属，俗名马蛇子，是变温动物，主要以昆虫为食[1]，在我国分布非常广泛，是麻蜥属中分布最广的种类，遍及东北、西北以及华北等地区[2]。密点麻蜥是荒漠草原和半荒漠草原上最常见的卵胎生蜥蜴，是生态系统的消费者，能保证能量遵循食物链和食物网的逐级流动，从而确保能量的有效传递，对荒漠化科学草原的生态系统具有极其重要的意义，它的存在可以帮助人们更好地评估当前的生态环境[3-5]。同时，密点麻蜥捕食的昆虫中害虫数量明显多于益虫数量，是对农业生产和人类生活有益的动物。近年来，由于自然环境的变化，密点麻蜥的生存环境也发生了较大变化，导致其数量日渐减少。因此，密点麻蜥被列入《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》，以此来保护它们的生存环境，维护其生存空间[6-7]。

微卫星 DNA 是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分，其单元长度介于1～6 bp 之间，形成簇状结构，被称为短串联重复序列（short tandem repeats，STRs)）或简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）。每个微卫星DNA 都由核心序列和侧翼序列组成，其核心序列呈串联重复排列，侧翼DNA 序列位于核心序列的两端，为保守的特异单拷贝序列，能使微卫星特异地定位于染色体常染色质区的特定部位。因此，通过微卫星DNA 标记能够获取大量的多态信息。经过多年的发展，微卫星DNA标记技术已成为一种非常有效的遗传标记手段，被广泛应用于遗传多样性评估、系统发育树构建、群体遗传结构和亲缘关系分析等领域。同其他分子标记相比，微卫星DNA 具有共显性、操作简便、可重复性好等特点，为研究动物系统进化关系提供了有力支持[8]。

该研究利用10 个微卫星引物，对2 个地理种群的16 个密点麻蜥样本进行遗传结构分析，以期探索密点麻蜥种质资源的演化形成过程，定义重要进化单元，并为密点麻蜥的保护利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

供试样本为从甘肃省张掖市高台县八坝村（GTBB）和宁夏回族自治区中卫市甘塘镇（GT）2个地区采集的16 只密点麻蜥，2 个地区各8 只，其中八坝村采集的样品编号为M154～M161，甘塘镇采集的样品编号为M171～M178。用无水乙醇与生理盐水按1 ∶1 的比例配成组织保存液保存样本，置于-20℃冰柜保存备用。

1.2 基因组DNA 的提取

将密点麻蜥样本从组织保存液中取出，用高温灭菌后的眼科剪取密点麻蜥的组织，用通用型基因组DNA 提取试剂盒提取样品总DNA，并用1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的完整性和浓度，将所提取的较高纯度的DNA 原液置于-20℃冰柜保存备用。

1.3 引物筛选及PCR 扩增

Chen 等[7]设计了 11 个密点麻蜥的微卫星位点，由于位点 Emu115 在实验过程中扩增结果不理想。因此该研究选用其他10 个位点进行PCR 扩增，分别为Emu49、Emu53、Emu55、Emu61、Emu65、Emu92、Emu93、Emu116、Emu131、Emu132。引物序列见表1，由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。

表1 密点麻蜥微卫星标记的引物信息

PCR 的反应体系（12 µL）：5×buffer（无Mg2+）2.4 µL，Immolase DNA 聚 合 酶0.06 µL，10 µmol/L上游荧光标记引物tag F（Fam、Ned、Vic、Pet）0.09µL，10 µmol/L 下游荧光标记引物tag R 0.09 µL，0.4µmol/L Primers（特异性引物）2.4 µL，合适浓度DNA 模板2 µL，无菌水补足12 µL。PCR 扩增程序：95℃预变性10 min；一阶段92℃变性60 s，50℃退火90 s，72℃60 s，5 个循环；二阶段92℃变性30 s，63℃退火90s，72℃延展60 s，20 个循环；三阶段92℃变性15 s，54℃退火30s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃延伸30 min[8]。用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，交由苏州金唯智生物科技有限公司进行毛细管电泳测序分析。

1.4 数据分析

用GeneMarker 软件对原始AB1 文件进行基因分型，分别将不同编号的2 条序列的波峰拼接得到比较完整序列的波峰图，删去错峰后保存其序列，所有数据采用 PopGen 32 和GenAlex V6.5 软件处理[9]，计算其等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、无偏预期杂合度（uHe）、香农信息指数（I）、近交系数（Fis）、分化系数（Fst）和基因流（Nm）等指标，并进行方差分析（AMOVA）。用Cervus3.0 软件计算各位点的多态信息含量（PIC）[10]。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增结果分析

用10 对微卫星引物对2 个地区的16 只密点麻蜥DNA 进行扩增，获得长度在200～300 bp 之间的目的条带，采用凝胶电泳检测，目的条带大小一致、亮度清晰（图1），符合预期，可进行后续的多态性分析。

图1 部分密点麻蜥样品的微卫星引物PCR 扩增结果

2.2 遗传多样性分析

由表2 可知，在16 只密点麻蜥中，10 对微卫星引物的Ne 值为0～0.619，Ho 值为0～0.619，He 值为0.309～ 0.737，uHe 值 为0.327～ 0.798，Fis 值 为-0.002～1.000，其中只有Emu61 的Fis 为负值，其余9 个位点都为正值，平均值为0.525。Fst 软件计算出的多态信息含量（PIC）在0.387～0.828 范围内，平均PIC值为0.703，其中只有Emu132 的PIC 值小于0.5，为0.387。由表3 可知，GT 群体的有效等位基因数（Ne）大于GTBB 群体的，分别为4.745 和1.697。GTBB 和GT 群体的观测杂合度（Ho）均值分别为0.253 和0.344，期望杂合度（He）分别为0.352 和0.765。GT 群体的I 值为1.669 ＞1，GTBB 群体的I值为0.540 ＜1。

表2 16 只密点麻蜥样品中10 个微卫星位点的遗传多样性

表3 两个群体遗传变异结果

由表4 可知，10 个微卫星位点在GTBB 群体上的等位基因数（Na）为 1.000～3.000；GT 群体的等位基因数为 4.000～9.000。GTBB 的平均I 值小于 1，说明该群体遗传变异程度较低；GT 的平均I 值大于1，说明该群体遗传变异程度较高。GTBB 的密点麻蜥种群平均He 值为0.353，GT 的密点麻蜥种群平均He 值为0.797。GTBB 的密点麻蜥种群平均Ho 值为0.253，GTBB 的密点麻蜥种群平均Ho 值为0.561。

表4 2 个密点麻蜥群体中10 个微卫星位点的遗传多样性分析

2.3 微卫星标记的遗传分化

为了能够更全面了解遗传距离与地理距离的相关性，根据试验结果绘制了基于 Nei's 地理距离与遗传距离之间的相关分析，结果如图2 所示，密点麻蜥的地理距离与遗传距离为正相关，P=0.010 ＜0.05，说明遗传距离与地理距离显著正相关，即：密点麻蜥的遗传结构随遗传距离和地理距离的变化而变化。

图2 基于Nei's 遗传距离与地理距离之间相关性检验

AMOVA 分析结果（表5）显示，2 个种群间的遗传变异占29%，种群内个体间遗传变异占71%，表明变异大部分存在于种群内，种群间遗传分化较小。种群内的遗传变异占总体变异相对较大，密点麻蜥种群之间的基因交流相对较少，整体的遗传变异绝大部分来自于个体间。

表5 密点麻蜥种群遗传变异的分子方差分析（AMOVA）

3 讨 论

3.1 密点麻蜥种群的遗传多样性

狭义的遗传多样性主要是指生物种内基因的变化，包括种内显著不同的种群之间以及同一种群内的遗传变异，是在一定时空范围内生物遗传变异的结果，是生物多样性的基础核心，其研究多从染色体、蛋白质和核酸3 个层面应用多种技术分析生物遗传物质的变化情况。不同的地理分布、生活环境、食性以及生存地域优势物种，都会对某一特定物种的遗传多样性产生影响，构成影响遗传多样性的外部因素[6]。香农指数（I）是衡量物种多样性的重要指标，其值越高，表明群体的遗传变异程度越显著，反之则越不显著[11]。GTBB 的I 平均值小于1，说明其遗传变异程度较低；GT 的I 平均值大于1，说明其遗传变异程度较高。衡量群体遗传变异的另一个重要参数就是基因杂合度，一般期望杂合度（He）越高说明群体的遗传变异越大。研究结果表明，GTBB的He 平均为0.353，说明其遗传变异较小；GT 的He 平均为0.797，说明其遗传变异相对较大。观测杂合度（Ho）越接近期望杂合度，说明群体受外来因素影响越小，处于遗传平衡状态[12]。GTBB 的Ho平均为0.253， He 平均为0.353，2 个数值较为接近，说明此群体受外来因素影响较小，处于遗传平衡状态；GT 的Ho 与He 相差也较小 （0.236），说明群体受外来因素影响较小，处于遗传平衡状态。

Ho 和He 还可用来评估遗传多样性，也就是群体内部多样性的水平，若Ho 低于He，则可能意味着遗传多样性较低，而这可能导致密点麻蜥的健康问题；反之，如果Ho 高于He，则可能意味着群体内部存在较高的遗传多样性，更有利于密点麻蜥的健康，让群体更好地遗传优良基因。研究结果表明，GTBB 和GT 这2 个密点麻蜥种群的Ho 平均值都小于He，遗传多样性较低，有害基因突变会逐渐累积，危害种群整体健康状况，另外加上人类活动或自然灾害的影响，物种濒危风险大增，因此，对2 地区密点麻蜥的保护迫在眉睫。

PIC 值用于衡量动物的种群多态性水平。根据其信息含量可分为高水平 （PIC ＞0.5）、中水平（0.5 ≥PIC ＞0.25）和低水平（PIC ≤0.25）。该研究中2 个密点麻蜥群体的10 个微卫星位点的平均多态信息含量的值为0.387～0.828，除Emu132 外，其他位点的PIC 都大于0.5，表明这些位点信息含量为高水平，具有高度多态性；只有Emu132 的PIC 值为0.387，小于0.5，表明Emu132 这个位点的多态性低，是低度水平多样性；其中Emu65 提供的遗传信息最多，PIC 最高（0.828）。

保护生物多样性的关键步骤是分析种质资源中的遗传变异，微卫星标记能揭示多个等位基因，并易于分离遗传相似的个体和同源基因组。在种群中发展新的或现存的独特等位基因主要与样本对生存条件和环境条件的适应有关。独特等位基因对于保护基因型的遗传多样性至关重要。分子标记为遗传多样性分析和基因组结构研究提供了工具。研究表明，等位基因（Na）是衡量微卫星位点多态性的重要参数，该研究选取的10 个微卫星位点中，除Emu49、Emu55、Emu132 外，其余7 个位点的等位基因均在4 个及以上，Na 平均为4.350。这表明可以利用这些微卫星位点来评估密点麻蜥的遗传多样性。有效等位基因数（Ne）可以更好地了解群体的遗传变异情况，因为它可以更准确地反映出等位基因的分布情况，从而更好地揭示出群体的基因组结构[13]。研究中2 个密点麻蜥群体在10 个微卫星位点上检测到的平均Na/Ne 的比值大于1，且平均等位基因数高于平均有效等位基因数，说明等位基因分布不均匀，造成比值较大的原因可能是近交带来的负面影响及样本数量太少所导致的。

3.2 密点麻蜥种群遗传结构和遗传分化

群体的遗传结构是指一个物种的基因组成，它们的频率和多样性取决于交配方式。掌握了不同时期遗传结构的演变方式就可以探讨生物的进化过程[14]。近交系数（Fis）可以反映出群体内的近交程度。当Fis 为正数时，说明该群体中有着密切的近亲关系；相反，当Fis 为负数时，说明该群个体之间有着较大的距离[9]。该研究表明，密点麻蜥群体间存在一定程度的基因交流；Fis 只有Emu61 为负值，其余9个位点都为正值，说明密点麻蜥群体近交明显，杂合子缺失。在此情况下，应适当提高杂合程度，否则种群的基因库无法得到更新，引进不了其他优良基因，长期下去密点麻蜥种群会衰退，最终有可能走向灭绝。

分化系数（Fst）介于0～0.05 之间时，说明2 个群体之间的遗传差异较小，可以忽略这一因素；当Fst 介于0.05～0.15 之间时，说明该群体的差异性较小；当Fst 介于0.15～0.25 之间时，群体之间的差异显著增加；当Fst 达0.25 以上时，群体之间的遗传差异会变得非常明显[15-16]。研究结果表明，2 个密点麻蜥群体之间的Fst 达到了0.209，说明2 个群体间遗传分化水平高，基因流小。而方差分析结果显示，种群之间的变异率达到了29%，而种群内的变异率达到了71 %，说明种群内部的遗传分化程度处于偏高水平。

4 结 论

当前，我国密点麻蜥群体的遗传多样性较为丰富，但由于其自身的迁徙能力、地理位置的不同以及其他外部因素的影响，导致个体之间的差异趋于明显，这也意味着它们的适应能力也会有所差异。随着生物资源的不断开发利用，人类必须正确理解并重视它们的遗传多样性变化。避免因过度开发导致物种遗传多样性大幅降低，增加密点麻蜥的濒危风险[17]。

环境和生物的相互关系是生态学的基本问题。在自然界中，环境梯度经常导致不同的自然选择，爬行动物因其扩散能力有限因此对外界环境尤其是温度的依赖性强[18]。该研究结果表明，宁夏回族自治区中卫市甘塘镇和甘肃省张掖市高台县八坝村2个地区分布的密点麻蜥种群的遗传结构存在较低的基因交流程度，在这种情况下，应引进优良基因，加强基因交流，提高群体的杂合程度，强化对密点麻蜥生存环境和物种资源的保护。

（致谢：万丽霞副教授与宋江平副教授对本研究样本采集做出了巨大贡献，在此致谢！）