浸渍方式对高海拔‘赤霞珠’葡萄酒挥发性风味物质的影响

梅源，苏周晨星，谭立杭，郭宾，索雨洁，段冰冰，闫银芳，刘旭*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100；2.四川省农业科学院农产品加工研究所，四川成都 610011；3.香格里拉酒业股份有限公司，云南迪庆 674400；4.五粮液仙林生态酒业有限公司，四川宜宾 644007）

生态条件是酿酒葡萄品质形成的重要基础[1]。在全球气候变化的大背景下，气温升高、紫外辐射增强以及水资源短缺等问题突出，显著影响了传统葡萄酒产区葡萄生长发育的物候期和生理生化特性，进而影响了葡萄酒品质[2-4]。为应对气候变化带来的影响，酿酒葡萄栽培常通过调节果际微气候来提高果实品质[5]，此外国内外酒庄还积极寻找更高海拔的葡萄酒产区。因为高海拔地区的平均气温普遍低于传统葡萄酒产区，且昼夜温差更大、光合有效辐射更强，有助于葡萄果实中积累更多的挥发性香气化合物和黄酮类次生代谢产物，这既能提高高海拔地区葡萄果实的抗逆性，又有利于获得优质的酿酒原料[6]。

有研究发现，海拔高度会影响葡萄果实中香气物质的积累[7]，进而造成葡萄酒中风味化合物种类、含量的变化，以及风味轮廓的差异[8]。Falcão等[9]对比了不同海拔葡萄园酿造的‘赤霞珠’葡萄酒风味物质差异发现，2-甲氧基-3-异丁基吡嗪类物质与海拔具有显著相关性，且葡萄酒呈现更浓郁的“甜椒”气味。Yue等[10]对云南高原5个不同海拔地区‘赤霞珠’葡萄酒的香气特征进行了研究发现，随着海拔升高，葡萄酒总挥发物的数量逐渐增加但浓度降低。此外，针对不同葡萄品种及所酿葡萄酒的酚类物质、抗氧化活性和感官质量特征等方面也有相关报道[7,11]。Berli等[12]研究发现，葡萄浆果比表面积随着海拔高度的增加而降低，从而有利于提高葡萄浸渍发酵过程中酚类物质和香气物质的可提取率。因此，高海拔葡萄酒往往呈现出更加突出的香气和口感[13]。

除了葡萄品种、生态条件、栽培管理和陈酿措施等因素外，浸渍工艺对葡萄酒最终的风味品质形成也至关重要[14]。尤其是当葡萄原料成熟度好，酚类物质、花色苷及优质单宁等含量充足时，采用加强浸渍工艺更有利于酿造出风味浓郁的高品质葡萄酒[15]。针对于此，前人研究了不同浸渍工艺对常见海拔地区葡萄酒品质的影响[14,16]。张娟等[17]探究了葡萄酒发酵结束后延长浸渍时间对葡萄酒香气和品质的影响，发现随着浸渍时间的延长葡萄酒的香气成分含量增加，且具有更浓郁的果香和植物香气。周继亘等[18]对比了多种浸渍工艺条件对葡萄酒香气物质的影响，发现冷浸渍工艺下酒样香气物质种类更多，且具有更好的感官特性。上述报道多针对单一的海拔高度因素或酿造工艺来研究其对葡萄酒风味及品质的影响，但在探索不同浸渍工艺对高海拔葡萄酒品质尤其是香气品质相关影响的研究却鲜有报道。

因此，本研究对我国西南高山产区高海拔‘赤霞珠’葡萄原料采用常规浸渍发酵、发酵前冷浸渍和发酵后延长浸渍3种方式，对所酿葡萄酒挥发性香气物质进行了测定，采用偏最小二乘判别分析（PLSDA）和香气活度值（OAV）等方法解析了3种浸渍工艺下葡萄酒风味的差异和特征物质，并结合感官评价探明了不同浸渍工艺对高海拔‘赤霞珠’葡萄酒香气品质的影响，以期为高海拔地区优质葡萄酒酿造工艺的优化提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 葡萄原料及试剂

试材为11年生‘赤霞珠’葡萄，2022年于商业采收期（9月25日）采自四川省甘孜藏族自治州得荣县日雨镇因都坝二号坝葡萄园（28°37’N，99°11’E），海拔2775 m，采用常规田间管理。

无水乙醇、酒石酸、氯化钠（均为分析纯），西安化学试剂站。超纯水由纯水制备仪Milli-Q（美国Millipore公司）制备。4-甲基-2-戊醇等香气成分标准品，Sigma-Aldrich公司（北京分部）。

1.2 仪器与设备

Lyza 5000 Wine全自动分析仪，安东帕有限公司（奥地利）；UV-1780紫外分光光度计，岛津仪器公司（苏州分部）；固相微萃取装置（SPME，Supelco，Bellefonte PA，美国），配联用手柄57330-U，萃取纤维50/30 μm DVB/CAR/PDMS；岛津QP2020气相色谱质谱联用仪（岛津，日本），色谱柱为毛细管柱DBWAX（60 m×0.25 mm×0.25 µm，Agilent J&W，美国）。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄酒酿造

参考干红葡萄酒小容器酿造规范[19]，略有修改。每个处理随机选取成熟度良好、健康无病的葡萄浆果20 kg。除梗破碎后，加入50 mg•L-1焦亚硫酸，倒入20 L玻璃发酵罐后，采用以下3种方式进行浸渍发酵：

常规浸渍（NM）：入罐后的葡萄醪立即加入20 mg•L-1果胶酶（Lallzyme Ex，法国）和200 mg•L-1酵母菌（Lallemand，法国），启动酒精发酵，每天压帽3次。酒精发酵结束后立即进行皮渣分离，在酒液中加入50 mg•L-1焦亚硫酸，于4 ℃冷库中澄清1个月，期间倒罐3次，去除酒泥，再将新酒封存于4 ℃冷库中贮藏3个月，待后续指标测定及感官评价。

发酵前冷浸渍（Pr-M）：将干冰加入发酵罐，使葡萄醪的温度降至4 ℃，保持冷浸渍7 d，待葡萄醪回温至12 ℃后加入20 mg•L-1果胶酶和200 mg•L-1酵母，启动酒精发酵。后续管理同NM。

发酵后延长浸渍（Po-M）：常规浸渍发酵结束后，继续每天压帽3次，保持葡萄皮渣被酒液持续浸渍7 d后，期间加入适量干冰使葡萄醪温度控制在18 ℃左右。浸渍结束后进行皮渣分离，后续管理同NM。

1.3.2 基本理化指标及酚类物质含量测定

采用葡萄酒全自动分析仪对不同处理下酿造所得葡萄酒的pH、酒精度、含糖量、可滴定酸含量等基本理化指标进行测定。总酚含量的测定采用福林-肖卡法，结果以没食子酸计；总单宁含量的测定采用甲基纤维素沉淀法（MCP）[20]，结果以儿茶素计；总花色苷含量的测定参考翦祎等[21]的方法进行，结果以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷计。

1.3.3 挥发性风味物质测定

采用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术（HS-SPME-GC/MS）进行测定。依次取葡萄酒样品5.0 mL、氯化钠1.0 g和4-甲基-2-戊醇内标溶液10 μL，置于20 mL顶空瓶中用于GC-MS分析；GC-MS设定条件参考李爱华等[22]的方法。测定所得结果经NIST14.L谱库检索，对其中匹配度大于750的物质进行定性分析。采用浓度为1.0 μg•L-1的4-甲基-2-戊醇为内标进行相对定量，挥发性风味物质相对浓度的计算参考毕芸杰[23]的方法。

1.3.4 感官评价

参考杨洁等[24]的方法对感官品评员进行训练，经考核筛选后组建感官品评小组。小组成员共20人，男女比例1∶1，由年龄在18～25岁的西北农林科技大学葡萄酒学院本科生及研究生组成。采用线性标度法[25]（0～10 cm）对酒样风味描述词的感官特性进行强度上的定量描述分析。

1.4 数据处理与统计分析

采用SPSS 26.0对数据进行方差分析、多重比较（Duncan，P≤0.05）；采用SIMCA 14.1软件进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘回归分析（PLSDA）。

2 结果与分析

2.1 浸渍方式对高海拔葡萄酒理化指标的影响

由表1可知，Po-M处理组酒样可滴定酸含量显著高于NM和Pr-M组，pH则显著低于其他两个处理。3个处理间酒样挥发性酸含量无显著性差异。不同浸渍方式下葡萄酒的酒精度均较高，为15.06%～15.64%（Vol，下同）。Po-M处理酒样的残糖含量显著高于其他两个处理，3种浸渍方式下酒样的残糖含量为2.51～2.70 g•L-1，表明所有酒样均为发酵完全的干型葡萄酒。总体而言，3种浸渍方式下的葡萄酒样均符合GB 15037—2006《葡萄酒》的相关要求。Po-M酒样的总酚含量为3.24 g•L-1，显著高于NM和Pr-M，而后两者间无显著性差异。3种浸渍方式下酒样的总花色苷和总单宁含量均无显著差异。

2.2 浸渍方式对高海拔葡萄酒挥发性风味物质影响

2.2.1 挥发性风味物质含量分析

利用HS-SPME-GC/MS方法得到的挥发性化合物，通过谱库检索共鉴定出73种物质，包括酯类34种、醇类30种、酸类4种、醛酮类4种、酚类1种（表2），其中在NM、Pr-M和Po-M处理酒样中分别鉴定出59、61、51种挥发性风味物质。由表2可知，3种浸渍方式的酒样中醇类和酯类物质的相对含量最高，总含量分别为602 851～652 904 μg•L-1和79 711～88 266 μg•L-1。此外，尽管各处理酒样的醇类和酯类物质总含量差异较小，但在种类上存在一定的差异。其中，NM处理酒样的醇类物质种类最多（27种），高于Pr-M（24种）和Po-M处理（20种）。而Pr-M处理酒样的酯类物质种类最多（29种），高于Po-M（25种）和NM处理（25种）。

表2 不同浸渍方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒挥发性风味物质的含量Table 2 Volatile aroma compounds content of high-altitude 'Cabernet Sauvignon' wine under diあerent maceration methods

为了明确不同浸渍方式下高海拔葡萄酒挥发性化合物的整体概况以及所鉴定出的化合物是否具有代表性，以不同物质的相对含量为X变量，不同浸渍方式为Y变量进行无监督的PCA分析。由图1可知，PC1和PC2累计解释所有变量的86.1%，可以表示所有样品的大部分信息。不同浸渍方式下葡萄酒挥发性风味物质在组成上具有较好的区分度，说明不同处理酒样挥发性物质的差异较大。其中Pr-M和Po-M处理分别与第一主成分呈现出负相关和正相关，且均与第二主成分呈负相关；NM处理主要与第二主成分呈正相关，这表明常规浸渍处理的酒样与增强浸渍（Pr-M和Po-M）后的酒样主要在第二主成分上存在差异。

图1 不同浸渍方式下高海拔葡萄酒挥发性风味物质PCA分析Figure1 PCA analysis of volatilearoma compounds in high-altitudewinesunder diあerentmacerationmethods

2.2.2 主要差异性和风味贡献化合物分析

为了进一步明确不同浸渍方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒样中具有差异性的主要挥发性风味化合物，对NM、Pr-M和Po-M处理下酒样中检测到的73种挥发性风味物质进行偏最小二乘判别分析，交叉验证R2为0.584，Q2为-0.029，表明模型未过拟合[26]，且PLS-DA模型的R2X为0.995，R2Y为0.998，Q2为0.993，表明模型稳定可靠[27]。PLS-DA分析双标图（图2A）中从大到小的椭圆分别表示置信度为100%、75%和50%。在模型中鉴定出9种VIP>1.0的差异贡献化合物（图2B），大部分为醇类化合物；其中1-戊醇（A38）与第二主成分呈现正相关，是NM处理相对Pr-M和Po-M处理下的主要差异化合物。另外，异戊醇（A37）、正己醇（A42）、苯乙醇（A60）和正丁醇（A36）等化合物与第一主成分呈负相关，是Pr-M处理酒样中的主要差异性风味物质；而乙酸乙酯（A1）、(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇（A48）、己酸（A65）和苯甲醇（A59）等风味化合物则与Po-M处理密切相关。结合图2A的结果表明，尽管大多数风味化合物与Pr-M处理酒样具有更强的相关性，但在主要差异化合物中具有代表性的风味物质数量与Po-M处理相同，且均高于NM处理。在加强浸渍处理中，Po-M处理酒样的主要差异化合物除了醇类化合物外还包括酯类和酸类化合物，因此在风味物质组成上较Pr-M酒样更加丰富。

图2 不同浸渍方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒挥发性风味物质PLS-DA分析Figure 2 PLS-DA analysis of volatile aroma compounds in high-altitude 'Cabernet Sauvignon' wines under diあerent maceration methods

香气活度值（OAV）是评价某单一香气化合物对食品整体香气贡献程度的指标[28]，尤其当OAV＞1时，表明该物质含量超过了人体感官阈值，是评估其对葡萄酒风味贡献的重要指标。3种不同浸渍方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒中OAV＞1的主要物质包括13种化合物（表3）。其中酯类化合物7种，醇类物质4种，酸类物质2种；OAV值最高的化合物为呈果香的异戊酸乙酯，其次是呈甜果香和草莓香的2-甲基丁酸乙酯，第三是呈现脂肪气味的己酸。尽管大多数酯类化合物在PLS-DA分析中并非差异化合物，但其含量对不同浸渍方式下葡萄酒的风味轮廓差异仍具有一定影响，尤其是OAV值较高的几种酯类物质中Po-M处理的最高，这表明Po-M处理酒样可能具有更多的果香特征。再结合VIP＞1的化合物发现，作为Pr-M处理酒样主要差异贡献物的异戊醇、正己醇和苯乙醇可能使Pr-M酒样呈现更多的花香和植物香气。然而NM处理酒样中，这些化合物的OAV值与其他处理的酒样相比，均位于中间值或最低值，表明NM处理下葡萄酒的花果香和植物香等香味强度低于增强浸渍处理后的样品。

表3 不同浸渍方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒中OAV>1的挥发性风味物质Table 3 Volatile aroma compounds with OAV> 1 in high-altitude 'Cabernet Sauvignon' wine under diあerent maceration methods

2.3 不同浸渍方式对高海拔葡萄酒感官品质的影响

为明确不同浸渍方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒香气感官特性的差异，感官品评小组对所有处理组酒样的风味特性进行了定量描述分析。不同的香气描述词根据其风味特性分为6类，分别是果香（包括覆盆子、黑醋栗、草莓、香蕉等描述词）；花香（包括紫罗兰、玫瑰等描述词）；植物（包括青椒、薄荷、香草等描述词）；烟熏、香料（包括烟草、胡椒、桂皮等描述词）；木头、坚果（包括橡木、雪松、烤杏仁等描述词）；脂肪（包括奶油、巧克力等描述词）。根据不同类别风味强度的得分情况绘制雷达图（图3）。NM处理酒样具有更浓郁的木头、坚果和脂肪味，而在花果香、植物香和香料等风味的强度上最低。和NM相比，Pr-M处理酒样的花香和植物香型更强，且具有中等强度的烟熏、香料味。Po-M处理酒样具有浓郁的果香和烟熏、香料味，以及中等强度的木头、坚果和脂肪味，而在花香和植物香上强度略低于Pr-M酒样。不同浸渍方式下葡萄酒风味轮廓的感官分析结果与VIP结合OAV值筛选出的关键风味物质基本符合，即酯类化合物如异戊酸乙酯、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯等含量较高的Po-M处理酒样更具果香，醇类物质如正庚醇、苯乙醇等含量较高的Pr-M处理酒样更具花香和植物香。

图3 感官分析雷达图Figure 3 Radar map of sensory analysis

3 讨论与结论

香气是表征葡萄酒感官质量的重要指标之一。由于酿酒葡萄中大多数风味物质及其前体物质主要存在于果皮中[33]，因此在葡萄原料品质较好的情况下常采用加强浸渍的方式来提高葡萄酒风味品质和整体质量。然而，针对不同的葡萄品种和原料品质，采用的加强浸渍方式也各不相同，因此本研究通过顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术对高海拔‘赤霞珠’葡萄在不同浸渍方式下酿造葡萄酒的挥发性风味物质的差异进行了检测分析。本试验共鉴定出73种化合物，其中醇类和酯类化合物种类和含量最高，占所有香气成分含量的98%，与前人的研究结果一致[17-18]。

不同浸渍方式会影响葡萄酒中挥发性物质的种类及含量[34]，发酵前冷浸渍处理葡萄酒中的风味化合物种类最多，较另外两个处理酒样的主要差异化合物为醇类物质，如由苯丙氨酸代谢产生的苯乙醇[17]以及正己醇等化合物，其独特的紫罗兰、玫瑰香气和青草味使葡萄酒呈现出更浓郁优雅的花香和植物香气。这是由于发酵前葡萄醪的冷浸渍有利于提高‘赤霞珠’葡萄酒中糖苷含量[35]，且有利于更多芳香类物质的浸出[18]。另外，本试验中发酵后延长浸渍处理葡萄酒的风味物质数量较常规浸渍处理更少，但其关键差异化合物的组成更加复杂，且葡萄酒风味贡献化合物中乙酸乙酯及脂肪酸等的含量更高。由于酯类物质是葡萄酒发酵香气中果香的主要贡献物质[29]，因此发酵后延长浸渍处理的葡萄酒表现出更浓厚的甜果香，且其中的差异化合物己酸具有的脂肪味也能有效调节葡萄酒风味的平衡性，从而丰富风味结构。值得注意的是，发酵后延长浸渍处理和发酵前冷浸渍一样可提高葡萄酒风味和品质，且发酵后延长浸渍能有效提高葡萄酒中的酚类化合物含量[14]，使葡萄酒更加饱满醇厚，并能在一定程度上弥补发酵前期产生的缺陷[17]，提高葡萄酒的整体风味。相比发酵前冷浸渍处理，发酵后延长浸渍处理葡萄酒风味产生的差异可能与其浸渍温度和浸渍阶段有关[36]，且发酵后延长浸渍相比发酵前冷浸渍可能延长了葡萄酒中酯化反应的进程，从而能萃取出更多的酯类物质。感官评价结果表明，增强浸渍处理能显著提升高海拔‘赤霞珠’葡萄酒的风味品质，尤其是发酵后延长浸渍较发酵前冷浸渍酿造的葡萄酒具有更浓郁的果香和更丰富的风味结构。

综上所述，以高海拔‘赤霞珠’葡萄为原料，经过加强浸渍处理的葡萄酒较常规浸渍处理具有更丰富的风味物质组成，且贡献差异的化合物含量更高，发酵后延长浸渍能使葡萄酒呈现出更丰富的香味类型。本研究结果为优化我国高海拔地区葡萄酒酿造工艺，进一步提升高海拔葡萄酒的品质提供了一定的理论和实践基础。