缺氧生物膜转型厌氧氨氧化生物膜培养与富集特性

蒋 睿 ,李 韧 ,于莉芳 ,2*,刘 然 ,刘 甜 ,张日霞 (.西安建筑科技大学环境与市政工程学院,陕西 西安70055；2.西北水资源与环境生态教育部重点实验室,陕西 西安 70055；.西安市政设计研究院有限公司,陕西 西安 70068)

以往污水处理厂脱氮除磷升级改造项目常通过在原有传统活性污泥生物脱氮系统中加入悬浮填料挂膜以增加生物量来提高反应池的容积效率,即固定生物膜-活性污泥(IFAS)工艺[1-2].而目前在双碳背景及污废水排放标准进一步提升的要求下,现有城市污水处理厂的高能耗换水质模式难以持续,亟需推广应用高效低耗的新型生物脱氮工艺[3].

厌氧氨氧化(Anammox)是近年来成功开发的新型生物脱氮技术,与传统硝化-反硝化工艺相比,Anammox 无需供氧和外加碳源,在总氮控制、污水处理和节能降耗等方面拥有巨大的优势[4].但由于厌氧氨氧化菌(AnAOB)生长速率慢、细胞产率低且活性受温度影响较大[5],目前,一般通过引入或培养具有良好沉淀性能的颗粒污泥、选用具有较高生物持留能力的反应器和引入载体构建生物膜系统这三种方法来富集AnAOB[6-8].其中,生物膜法凭借其污泥停留时间长、工程改造成本较低等优势而受到广泛关注[9],但如何快速培养大量的Anammox 生物膜是限制其在工程上大规模推广应用的一个瓶颈.

现有调查研究发现城市污水处理厂缺氧池填料上的生物膜中存在着一定丰度的AnAOB,如西安市某污水处理厂(IFAS 工艺)缺氧生物膜中的AnAOB 丰度达到0.11%[10],远高于传统城市污水处理厂絮状污泥中报道的相对丰度(0.003～0.01%)[11-12].研究还发现污水处理厂缺氧池海绵载体上出现了红色Anammox 生物膜,且其Anammox脱氮速率是反硝化的4.85 倍[13].如果能利用污水处理厂现有填料快速培养具有较高活性的Anammox生物膜,就有可能有效解决工程上Anammox 生物膜培养问题.

本研究引入西安市某污水处理厂缺氧池填料启动UAFB(升流式厌氧固定床生物膜)-Anammox反应器,逐步提高氮负荷以培养Anammox 生物膜,探究富集培养过程中Anammox 生物膜特性和菌群变化情况,以期为双碳背景下污水处理厂的提标改造提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 试验装置及运行

采用UAFB-Anammox 反应器(图1),有效容积5.0L,填料区容积3.5L,填充率70%.通过恒温水浴将反应器内温度控制在(33±2)℃;通过外部循环泵使内部水流充分混合;在进水中添加NaHCO3将pH 值控制在7.5～8.2;所用接种填料均取自西安市某污水处理厂的缺氧池,填料比表面积为500m2/m3,初始Anammox 活性为(0.11±0.03)g/(m2·d).

图1 UAFB 反应器示意Fig.1 Schematic diagram of UAFB-Anammox reactor

整个实验运行过程分5 个阶段,各阶段表面氮负荷率(SNLR)逐步增加.反应器以序批式运行,具体运行参数、周期、水力停留时间(HRT)见表1,每个周期进水5min,出水5min,闲置5min,换水比为50%.

1.2 试验用水

试验用水采用人工配制,进水使用NH4Cl 和NaNO2配制NH4+-N 和NO2--N(具体浓度见表1),控制NH4+-N :NO2--N= 1 :1.32;KHCO30.5g/L;MgSO4·7H2O 0.14g/L;CaCl2·2H2O 0.14g/L;KH2PO40.03g/L 并配制一定浓度的微量元素[14].

1.3 分析项目及方法

NH4+-N、NO2--N 和NO3--N 浓度的测定采用标准分析方法[15],pH 值及溶解氧(DO)分别采用雷磁PHS-3C pH 计和Seven2Go S9 型溶氧仪(Mettler Toledo,瑞士)进行测定.

生物膜厚度测定采用显微镜法,先用冷冻切片机(Leica CM1950,德国)对预先包埋过的填料进行切片,然后通过尼康50i 电子显微镜(Nikon,日本)观测生物膜厚度,多次测定取平均值;生物膜干重测定采用差值法[16].

Anammox 最大活性采用直接取样法进行异位测定,以氮素浓度变化来确定Anammox 活性[17];血红素采用吡啶血红素分光光度法进行测定[18].肼氧化酶(HZO)利用低温高压连续细胞破碎仪(JN-02C,广州聚能纳米生物科技有限公司)进行提取,具体方法参照文献[19-20].

1.4 计算方法

Anammox 表观活性(以NH4+-N 计)根据公式(1)计算:

式中:[NH4+]inf为进水氨氮浓度,mg/L;[NH4+]eff为出水氨氮浓度,mg/L;70%为反应器的填充率;HRT 为水力停留时间,h;500 为填料的比表面积,m2/m3.

1.5 高通量测序

DNA 的提取采用美国MoBio 公司的PowerSoil DNA 试剂盒,提取后的生物膜样品使用1%凝胶电泳检查所提取DNA 片段纯度.以提取的DNA 片段为PCR 模板,采用引物序列515a(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)在Miseq PE300 平台(Illumina,USA)对DNA样品的16S rRNA 基因的V4 区进行扩增.具体测定方法参考文献[21].

2 结果与讨论

2.1 脱氮性能

本实验根据进水负荷差异共分为5 个阶段,UAFB-Anammox 反应器的脱氮性能及各阶段Anammox 活性变化如图2所示.

随着网络经济的不断发展，未来五到十年后，社会消费群体将以90后、00后为主流，他们更能运用网络技术手段满足自己的需求，他们对实体店的依赖度会更加低。同时，他们更追求个性化，追求自我需求，不盲目跟从，传统的营销方法难以吸引这类人群。另外，由于网络的全天候和全球性，加上无线互联技术的逐步成熟，消费者可以随时随地传达自己的需求信息，只有互联网经济能满足消费者在碎片化时间购物的需求。

图2 UAFB-Anammox 反应器中氮浓度、负荷及Anammox 活性的变化Fig.2 The variation of nitrogen concentration,SNLR and anammox activity

2.1.1 快速启动阶段(阶段 Ⅰ)考虑到接种填料的初始Anammox 活性相对较低((0.11 ± 0.03)g/(m2·d)),较高浓度的游离氨(FA)及游离亚硝酸(FNA)会对初期AnAOB 形成抑制[22],所以反应器的初始SNLR 设计为0.23g/(m2·d)(以TN 计),即0.1g/(m2·d)(以NH4+-N 计).

运行第1～5d,反应器出水NH4+-N 浓度高于进水,出水TN 浓度从59.82mg/L 增加至67.11mg/L,这可能是接种填料上的部分微生物(尤其是异养菌)无法适应新环境,进而发生菌体自溶现象,释放出部分有机物及NH4+-N 导致的[7].

第6～16d,出水NH4+-N 浓度从29.06mg/L 逐渐降低至4.76mg/L,出水NO2--N 浓度在24.41mg/L 左右波动,出水 NO3--N 浓度从 4.06mg/L 上升至8.86mg/L,TN 去除率从22.69%增加至68.18%,这可能是反应器内少量的氧气引起的部分硝化和Anammox、部分反硝化共同造成的.之后,出水NH4+-N 和NO2--N 浓度开始同步降低,TN 去除率逐步上升,反应器Anammox 现象逐渐明显.培养至29d时,反应器NH4+-N 和NO2--N 去除率分别达到96.53%和 98.88%,TN 去除率和去除负荷高达76.22% 和 1.77g/(m2·d),且第 17～29d 内,出水NH4+-N、NO2--N 的去除量和NO3--N 的生成量之间呈现一定比例,(1 :1.31 :0.33)与Strous 等[23]提出的理论值(1 :1.32 :0.26)接近,这均说明UAFBAnammox 反应器的成功启动.

本实验反应器接种缺氧生物膜所需启动时间(29d)与以往接种厌氧颗粒污泥(140d)[24]、硝化-反硝化污泥(94d)[25]和常规活性污泥所需接种时间(60d)[26]相比,大幅缩短.这是因为在接种反硝化池中,反硝化过程产生的NO2--N 和进水中带入的NH4+-N 在此处同时存在,为AnAOB 的生长提供了必要的基质条件,同时生物膜又给AnAOB 提供了一定的持留环境,这使得缺氧生物膜中含有一定丰度的AnAOB.同时有研究表明,在接种污泥中预先富集AnAOB,反应器能更快的检测出Anammox活性[27].

第 30～91d,反应器进入稳定运行状态,出水NH4+-N 及NO2--N 浓度均小于3mg/L,去除率均达98%以上,出水NO3--N 浓度为(22.15 ± 4.12)mg/L,TN 平均去除率为70.28%,Anammox 最大活性增长至(0.16 ± 0.04)g/(m2·d)(第91d).反应器成功启动后,通过提高进水基质浓度和缩短HRT 提升SNLR 以进一步富集AnAOB.

如图2所示,SNLR 由0.35g/(m2·d)(阶段Ⅱ)提升至2.59g/(m2·d)(阶段 Ⅴ),Anammox最大活性由(0.16±0.05)g/(m2·d)(第101d)提升至(2.20±0.12)g/(m2·d)(468d),提升了1275%,AnAOB 富集效果显著.但在阶段Ⅴ末期Anammox 最大活性出现小幅下降,由(2.20± 0.12)g/(m2·d)(468d)降低至(2.15 ± 0.07)g/(m2·d)(492d),这可能是随着生物膜上AnAOB 的不断富集,生物膜空隙逐渐变小,甚至逐渐出现了堵塞现象(图3)所导致的[28].最终UAFB-Anammox 反应器最大活性维持在(2.15 ± 0.07)g/(m2·d),负荷提升结束.

图3 缺氧生物膜转型厌氧氨氧化生物膜过程中的形态变化Fig.3 The morphological changes of the biofilm during the culturing process

2.2 Anammox 生物膜特性

图3 为生物膜在转型培养过程中的形态变化.如图3a所示,悬浮填料表面较为粗糙,且有较多小凸刺,适宜生长缓慢的AnAOB 附着生长,填料表面黏性物质将微生物紧紧黏附在一起,形成了较为密实的生物膜结构.如图4所示,从接种到培养至137d,生物膜厚度由(147.17 ± 73.22)µm 增长至(437.48 ±196.39)µm,随着SNLR 进一步增加,生物膜厚度最终培养至(774.07 ± 140.87)µm.同时,生物膜干重也从(98.18 ± 9.31)mg/个增加到(250.80 ± 5.35)mg/个.

图4 生物膜培养过程中质量和厚度的变化趋势Fig.4 The variation of biofilm quality and biofilm thickness during the culturing process

整个负荷提升过程中,生物膜颜色呈现出黑褐色-红棕色-橘红色-胭脂红的变化.由于接种填料是取自缺氧池的生物膜,膜上富集的大多是类似反硝化菌的异养菌群,所以接种生物膜呈现黑褐色.培养至第137d时,生物膜中不适宜环境的微生物菌体被淘汰,生物膜变为红棕色,AnAOB 在生物膜中逐渐富集;培养至357d 时,生物膜呈现橘红色;第492d 时,生物膜呈胭脂红色.对比357 和492d 的生物膜发现,进一步提升SNLR 后培养的生物膜更为密实,这可能是由于生物膜在培养过程中,微生物会向体外不断分泌高分子的胞外聚合物(EPS),EPS 会覆盖在微生物聚集体表面或者填充在细胞之间,从而使生物膜变得相对紧实[29].

培养终期生物膜颜色偏向暗红,这表明Anammox 生物膜已成熟,Anammox 活性达到一个较高值((2.15 ± 0.07)g/(m2·d)).此时生物膜具有一定厚度((774.07 ± 140.87)µm),但孔隙率降低(图3),与此时Anammox 最大活性出现小幅下降(由(2.2 ±0.12)g/(m2·d)降低至(2.15 ± 0.07)g/(m2·d))结果一 致.

2.3 HZO 活性和血红素含量

AnAOB 介导氮转化过程中有多种酶的参与,其中HZO 是AnAOB 所特有的酶[30].同时血红素c 是AnAOB 中参与主要代谢反应的重要辅助因子,具有催化和电子传递的潜力,可用作评估Anammox 性能的指标[31].为了建立UAFB-Anammox 生物膜反应器脱氮性能与HZO 活性的关系,分别选取接种填料以及第137,357 和492d 的生物膜进行HZO 活性和血红素含量测定.

如图5所示,接种填料上HZO 活性很低,而随着UAFB 反应器的成功启动,Anammox 生物膜上的HZO 活性呈明显增加趋势,第137,357 和492d 时生物膜HZO 活性分别为(0.75 ± 0.08),(1.73 ± 0.15)和(2.03 ± 0.17)µmol/(个·min),同时反应器也表现出较稳定的脱氮效果.血红素变化结果显示,相较于接种填料的血红素含量(0.03µmol/个),第137,357 和492d生物膜的血红素含量分别增加了333.38%、607.08%及960.60%.相关性分析结果显示,本研究中SNLR与 HZO 活性、血红素含量都呈显著正相关(P<0.05,P<0.05).这说明AnAOB 在应对负荷不断提升的环境下,逐步适应并成功富集.

图5 生物膜培养过程中血红素含量和HZO 活性的变化趋势Fig.5 The variation of heme content and HZO activity during the process of biofilm cultivation

2.4 生物膜群落结构变化

2.4.1 门水平 如图6a所示,接种填料上微生物种类丰富,其优势菌门(相对丰度>5%)有脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes),同时还含有 2.62%的浮霉菌门(Planctomycetota).随着培养的进行,生物膜内微生物群落结构变化显著.培养至 137d 时,生物膜内AnAOB 所属的Planctomycetota 门相对丰度大幅度上升至 48.05%并占绝对优势,次优势菌门为Proteobacteria,而 Bacteroidota 、 Chloroflexi 、Firmicutes 和Desulfobacterota 则大幅下降.

图6 生物膜中的微生物群落结构变化Fig.6 Changes of microbial community structure

2.4.2 属水平 如图6b所示,接种生物膜中优势菌属(相对丰度大于2%)主要包括具有脱硫功能的Desulfobacterium(3.89%)、Desulfomonile(2.37%)和具有反硝化功能的Denitratisoma(2.26%),同时,检测到的AnAOB 菌属为Candidatus_Brocadia(0.88%).第137d,生物膜中Desulfobacterium、Desulfomonile被淘汰(相对丰度<0.01),Denitratisoma 的相对丰度增长至7.40%,Ca.Brocadia 被高度富集,其相对丰度从培养前的0.88%增至28.88%,占绝对优势.第357d时,生物膜中检测出 1.64% Candidatus_Jettenia,AnAOB 多样性增加.第492d 时,Ca.Brocadia 和Ca.Jettenia 相对丰度分别为33.38%和3.02%,AnAOB 富集效果明显,这是Planctomycetes丰度显著增加的主要原因,也是反应器Anammox 脱氮效率提升的关键.

此外,作为接种生物膜上两种丰度较高的反硝化菌,Denitratisoma(2.26%)和Comamonas(1.99%)在反应器 SNLR 提升过程中,相对丰度呈现出相反变化.Denitratisoma 相对丰度增长至(6.85±1.28)%,与已有研究[32-33]中的丰度相近,而Comamonas 丰度则不断下降,最终降低至0.03%,被系统淘汰.此现象表明在AnAOB 富集过程中,生物膜上存在着细胞代谢或者劣势菌群被淘汰后的有机物,而Denitratisoma 具有较强的与AnAOB共存的能力[32],Denitratisoma消耗这些有机碳源,并利用Anammox 过程中产生NO3--N,将其还原成N2,进一步提高反应器的脱氮效率.

3 结论

3.1 采用污水处理厂缺氧池填料,经29d 快速启动了Anammox 生物膜反应器.SNLR 由0.23g/(m2·d)提升至2.59g/(m2·d)的过程中,生物膜厚度从(147.17±73.22)μm 增加至(774.07±140.87)μm,反应器TN 去除率高达83.68%.

3.2 在Anammox 生物膜培养过程中,血红素含量和HZO 活性均与SNLR 呈显著正相关,生物膜颜色也呈现出红棕色-橘红色-胭脂红的变化,培养结束时,HZO 活性由(0.75±0.08)µmol/(个·min)增至(2.03±0.17)µmol/(个·min),反应器最大Anammox活性维持在(2.15±0.07)g/(m2·d).

3.3 富集后的生物膜中优势门为Planctomycetota,相对丰度为48.05%;Anammox 菌属为Ca.Brocadia和Ca.Jettenia,其中Ca.Brocadia 相对丰度从培养前的0.88%增至33.38%.说明采用城市污水处理厂缺氧生物膜转型培养Anammox 生物膜这一方法具有工程应用可行性.