持续负荷冲击下AnSBBR运行性能及群落结构响应

王 泽 ,于莉芳 *,马芷萱 ,郑兰香 ,刘 然 ,刘 甜 (.西安建筑科技大学环境与市政工程学院,陕西 西安70055；2.宁夏大学生态环境学院,宁夏 银川 75002；3.中国葡萄酒产业技术研究院,宁夏 银川 75002)

废水水质水量的波动对厌氧生物处理系统产生有机负荷冲击,打破系统内产酸和产甲烷的动态平衡,从而降低系统中污泥强度[1]、影响胞外聚合物(EPS)分泌[2]、改变微生物群落结构及代谢途径[3],导致系统缓冲能力下降、甲烷产量低以及挥发性脂肪酸(VFA)积累.目前,厌氧系统负荷冲击的研究主要集中在瞬时高负荷冲击和长期逐级负荷冲击对消化系统性能的影响.一般认为,可通过序批式进水[4]、延长水力停留时间[5]和提高回流比[6]等方式来抵抗负荷冲击,也可通过投加填料形成厌氧生物膜,增加系统中生物浓度和多样性来保证运行的稳定性[7].厌氧序批式生物膜反应器(AnSBBR)兼备序批式系统和厌氧生物膜法,序批式系统自动化程度高、厌氧生物膜法运行成本低适宜小型酒庄,并且其抗负荷冲击能力已在多个行业的废水处理研究中被证实[7-8].但是,生产季葡萄酒生产废水的持续负荷冲击对AnSBBR 的消化性能、生物膜活性及微生物群落结构的影响仍有待研究.

截止2020年底,宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的种植面积为3.28×104hm2,产量约10.0×107L,产区约93.1%的酒庄规模小于1500t/a,55.69%的酒庄选用厌氧生物法处理生产废水[9].葡萄酒生产废水主要来源于加工设备的清洗和残液的排出,具有低pH值、高色度、高有机浓度及可生化性好等特性,是一种典型的季节性生产废水,主要集中在9～11月,且在生产季每日水质、水量波动大,这一点在小型酒庄尤为突出[10-11].课题组对贺兰山东麓地区29 家酒庄调研发现,大部分酒庄的废水处理设施未充分考虑废水水质水量的变化特征,其实际产能仅为设计产能的20%～50%,存在设备浪费、运行成本高等问题[9].

基于此,试验采用AnSBBR 处理葡萄酒生产废水,通过监测反应器的消化效果、运行稳定性、产甲烷活性和群落结构响应来考察AnSBBR 在持续负荷冲击下的表现.以期为AnSBBR 抗负荷冲击研究和推动AnSBBR 处理葡萄酒生产废水工程化应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验装置与接种污泥

AnSBBR,φ270mm×360mm,有效容积为10L,运行温度为(35±1)℃ ,HRT=20h,T=6h.前期研究已确定反应器最佳运行负荷(OLR=5.4g/(L·d))并运行60d以上[8].

1.2 废水组成

基于葡萄酒生产废水的主要来源、课题组对葡萄酒及其生产废水中有机物组成及浓度的测定,试验通过稀释葡萄酒以模拟葡萄酒生产废水,葡萄酒中COD 为(221020±2100)mg/L,总磷为(31±2)mg/L,总氮为(1524±37)mg/L,乙酸为(1410±13)mg/L,多糖(PS)为(2525±45)mg/L,蛋白质(PN)为(18045±189)mg/L,pH 值为(3.99±0.20).投加(2000±20)mg/L 的NaHCO3调节进水pH 值.

1.3 试验设计

根据进水COD 将AnSBBR 的运行分为三个阶段,如表 1所示.阶段 I(1～28d),在进水 COD 为4500mg/L 下稳定运行,作为AnSBBR 持续负荷冲击试验的基准;阶段 Ⅱ(29～56d),通过设置进水COD 为3500 和5500mg/L(24h 转换一次),诱导反应器内形成持续的有机负荷冲击;阶段Ⅲ(57～84d),进水COD恒定为4500mg/L,进行恢复运行.

表1 AnSBBR运行参数Table 1 Operation parameters of AnSBBR

1.4 分析项目及方法

1.4.1 理化指标分析 COD、TS、VS、pH 值采用标准方法测定;部分碱度(PA)和总碱度(TA)使用滴定法[12]测定,碳酸氢盐碱度(BA)为1.2PA;总多酚(TPP)浓度采用福林酚法[13]测定;EPS 提取及PN、PS浓度参照文献[5]测定;电子传递活性(INT-ETS)参照文献[14]测定;辅酶F420浓度参照文献[15]测定;产气量使用湿式气体流量计计量;气体组分使用TCD-气相色谱仪(SP-3420A)测定;VFAs 使用FID-气相色谱(SP-3420A)测定;三维荧光使用荧光光度计(日立F-7000)测定.

1.4.2 基于乙酸的比产甲烷活性(SMA)从AnSBBR 取数个生物膜进行测试,步骤如下:生物膜填料用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3 次后置于250mL厌氧瓶中,加入150mL 由NaAc、NH4Cl、KH2PO4和NaHCO3组成的营养液,设置不添加无水乙酸钠的对照组.氮吹5min 排除瓶中空气,随后将厌氧瓶置于 35℃水浴摇床中连续运行 36h.利用修正的Gompertz 模型方程拟合产甲烷的动力学参数[8].

式中:Pt为t 时刻累积甲烷产量,mL/gTS;Pmax为最大甲烷产量,mL/gTS;Rmax为最大甲烷产率,mL/(gTS·h);e=2.7183;λ 为停滞时间,h;U 为最大SMA,gCOD/(gTS·d).

1.4.3 基于H2/CO2的比产甲烷活性 氢利用速率(HUR)参照文献[16]测定,从反应器中取数个填料用PBS 清洗后置于厌氧瓶(500mL)中,向厌氧瓶中加满缓冲溶液(由NH4Cl、KH2PO4和NaHCO3组成).将200mL 混合气体(VCO2:VH2:1:4)注入瓶中等体积替换瓶内缓冲液,打开蠕动泵使瓶内气体循环,U 形压力计监测瓶内压力,N2平衡厌氧瓶顶空压力和外部压力.最后,定期对瓶内顶空气体进行采样和分析,试验共持续6h.HUR 活性根据等式(3)和等式(4)计算.

式中:HUR′为最大的 H2利用率,mL-H2/(gTS·h);HUR 为最大SMA,gCOD/(gTS·d);V 为顶空体积,mL;X 为总生物量,gTS;0.633 为35℃运行条件下的转化系数.

1.4.4 微生物群落结构分析 微生物群落结构分析采用Illumina MiSeq 高通量测序,分别在反应器运行的28,56 和84d,取生物膜进行高通量测序分析.使用通用特异性引物515FmodF(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和 806RmodR(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′),对全菌16S rRNA 基因进行PCR 扩增,扩增区域为V4,测序深度为(38843± 1714),利用Illumina 公司的Miseq PE250 平台进行测序.

1.4.5 数据处理 运用Canoco 5.0 进行冗余分析(RDA);运用 SPSS 25 进行相关性分析,并根据Pearson 相关性结果使用Origin 2023 绘制图形.

2 结果与讨论

2.1 AnSBBR运行效果及稳定性

2.1.1 AnSBBR运行效果 如图1a所示,阶段I(1～28d)进水COD 恒定时,出水COD 为(163.3±21.4)mg/L,去除率为(96.4±0.5)%;阶段 Ⅱ(29～56d)的29～41d 中出水COD 为(188.5±81.1)mg/L,去除率为(95.6±1.6)%,反应器仍保持对COD的高效去除,出水COD 满足《农田灌溉标准》[17]旱作水质标准,可继续用于植被灌溉.以往研究表明[7],AnSBBR 可以应对瞬时高负荷冲击,有较好的抗负荷冲击能力.之后,随负荷冲击的持续,出水 COD 逐渐增加,达到941.3mg/L(56d),去除率降至83.0%.阶段 Ⅲ(57～84d),经8d 恢复后,出水COD 降至200mg/L.与混合式USBF 反应器相比,不仅在负荷冲击下COD 去除率更高,且恢复稳态所需时间更少[18].

图1 AnSBBR 的性能表现Fig.1 Operation performance of AnSBBR

沼气组分可反映反应器的性能及运行状态,阶段I 和阶段Ⅲ沼气中甲烷占比相近(约73.4%)(图1b).阶段 Ⅱ,沼气中甲烷比例和氢分压增加,在50～56d 时分别为(79.3±1.4)%和(528.3±365.4)Pa,甲烷产量持续降低,从19.6L/d(29d)降至15.7L/d(56d).通常,厌氧消化中H2由发酵细菌代谢单糖或产氢产乙酸菌降解VFA 产生,保持低氢分压有利于产氢产乙酸和嗜乙酸产甲烷过程的进行[5].生物膜结构会使溶解氢在其内部传递时存在浓度梯度,在溶解氢传质限制下存在低氢分压微环境,保证产氢产乙酸的自发进行[19].负荷冲击后逐渐增加的氢分压有助于嗜氢产甲烷菌的生长,这与文献[20-21]结果一致.

多酚类化合物主要存在于葡萄皮和籽中,随酿酒生产工序进入废水中.其种类繁多、组分复杂,导致生物降解效果较差[22].各阶段总多酚去除率为(43.0±3.9)%、(42.3±3.1)%和(43.9±3.8)%(图1c);废水的色度源于多酚类化合物,各阶段脱色率为(41.9±1.9)%、(40.2±2.4)%和(40.6±2.4)%(图1d),持续负荷冲击未对总多酚去除率造成明显的影响,推测是总多酚浓度未超过微生物的耐受阀值.

2.1.2 稳定性 VFA 是厌氧消化过程中有机物转化为甲烷和CO2的中间代谢产物,其浓度可表征反应器运行性能变化.出水VFAs 浓度如图2a所示,阶段I 中VFAs 基本为乙酸,其值为(129.5±8.4)mg/L.阶段 Ⅱ,随着持续负荷波动VFAs 开始累积,在56d时 VFAs 浓度为 858.3mg/L,其中,乙酸达到740.5mg/L,丙酸、丁酸和戊酸增加,分别为63.0,18.3和36.5mg/L.阶段 Ⅲ,系统中累积的VFAs 被利用转化,在66d 时乙酸降至180.0mg/L,丙酸、丁酸和戊酸低于15.0mg/L.持续负荷冲击下VFA 大量积累,一方面是废水由大量溶解性有机酸和醇组成,可生化性好、降解快;另外,产甲烷菌对环境变化敏感,过高的氢分压抑制乙酸向甲烷的转化.

图2 AnSBBR运行稳定性Fig.2 Operation stability of AnSBBR

碱度在维持系统酸碱平衡方面发挥重要作用.阶段I,出水TA 为(1550.7±29.2)mg/L(图2b),出水pH值为(7.34±0.04)(图2c).在29～41d 内(阶段 Ⅱ),出水TA 缓慢降低((1517.2±44.7)mg/L),pH 值仍维持在(7.25±0.09),适宜厌氧微生物的弱碱性环境.随负荷冲击时间增加,在56d 时出水TA 为1175.5mg/L,pH值降至7.0 以下;与TA 相比,出水PA 降幅更大,从1275.5mg/L(41d)降至550.2mg/L(56d).阶段 Ⅲ,在恢复的第4 天(60d)时出水TA 和PA 分别达到1400.0和1158.3mg/L.

系统缓冲能力由碱度和VFAs 共同作用,是评估反应器运行稳定性的关键指标.在 29～41d 内,VFA/TA 为(0.10±0.05),BA/TA 为(1.01±0.03),VFA/BA 为(0.10±0.04).一般认为,VFA/TA <0.4 时系统处于稳定状态[23].Vital-Jacome 等[24]使用CSTR 处理葡萄酒废水时控制运行 pH 值和碱度,但系统中VFA/TA 仍大于0.5,运行稳定性较差.在56d 时VFA/TA 为0.72,BA/TA 为0.56,VFA/BA 为1.29.厌氧缓冲体系中碳酸氢盐碱度与VFA 反应生成挥发性碱度,其提供的缓冲能力较弱,当系统中VFAs 积累后导致VFA/BA>1.2.Li 等[12]发现VFA/BA 响应最快,可作为预警指标,当比值超过1.2 后预示系统即将酸化.

2.2 EPS 变化

如图3所示,反应器稳定运行时(阶段I),各层EPS 浓度及组成比例基本稳定.与28d 相比,在42d 时仅外层的Slime-EPS 浓度增加较为明显,增加34.1%;在56d 时LB-EPS 和TB-EPS 浓度显著增加,分别增加61.3%和62.8%,达到31.46和66.85mg/ gVSS.EPS 作为包裹在细胞外围的大分子物质,是保护和维持细胞结构和活性的屏障,持续负荷冲击下微生物需要更多的EPS 来抵抗环境胁迫.相比TB-EPS,LB-EPS 浓度增加较小,因为LB-EPS 由小分子物质组成,当其浓度过高时会降低密度、增加空隙[25].阶段 Ⅲ,反应器趋于稳定,代谢有机物的速率加快,EPS 浓度逐渐降低.

图3 EPS 组分浓度变化Fig.3 Variation of EPS during the procession of operation

由于EPS 存在于污泥表面,当环境改变时其组成成分更易受到影响[26].各层EPS 中PN/PS 比值在遭受负荷冲击后均有所增加,在56d 时达到最大,分别为 2.87、4.02 和 5.04,相应提高了93.9%、197.8%和126.0%(与28d 相比).PN 具有高疏水性和负电荷性,较高的比值有助于黏附絮凝,避免因负荷冲击而导致的生物膜解体[2].阶段Ⅲ,TB-EPS 和LB-EPS 浓度及PN/PS 比值逐渐降低.

为了进一步探究持续负荷冲击对生物膜EPS的影响,测定各阶段下EPS 的三维荧光(图4).根据文献[27],腐殖酸类物质波长区间为 250～400/380～500nm,溶解性微生物代谢产物250～400/280～380nm,蛋白质类物质色氨酸200～250/300～380nm,富里酸类物质200～250/380～500nm.

图4 EPS 三维荧光光谱图Fig.4 Three dimensional fluorescence spectra of EPS

EPS 主要由蛋白质类物质色氨酸、溶解性微生物代谢产物和腐殖酸类物质组成.在28d 时,与Slime-EPS 相比,LB-EPS 各物质含量更低,TB-EPS中蛋白质类物质色氨酸更多,而腐殖酸类物质较少.持续负荷冲击下TB-EPS 中峰发生变化,但仍以蛋白质类物质色氨酸、溶解性微生物代谢产物为主,LB-EPS 中腐殖酸类物质含量增加.LB-EPS 先接触有机物并降解转化,腐殖酸类物质含量较高,TB-EPS 靠近细胞,需要大量的蛋白质来维持结构稳定[25].阶段 Ⅲ,在84d 时结果与28d 类似,经过稳定运行后EPS 重新与环境和微生物达成了新的平衡.这表明,持续负荷冲击激发了保护机制,EPS 分泌大量的应急性蛋白类产物以应对环境胁迫.研究显示[28],分泌的EPS 中含有的类黄素和细胞色素等活性物质,可作为电子转移媒介参与细胞的胞外电子转移过程.

2.3 生物膜活性

2.3.1 比产甲烷活性 SMA 表示微生物产甲烷潜力和对COD 的去除能力,是表征生物膜活性的重要参数.代谢底物的性质决定了产甲烷菌的类型、数量及代谢途径,如图5所示,各阶段中HUR 活性高于乙酸SMA 活性.稳定运行期间(阶段I),比产甲烷活性基本相同.与 28d 相比,在 42d 时 HUR 达到0.341gCOD/(gTS·d),增加16.8%,乙酸SMA 活性为0.050gCOD/(gTS·d),降低25.4%;随着负荷冲击的持续,在56d 时HUR 达到0.494gCOD/(gTS·d),增加69.2%,乙酸SMA 为0.035gCOD/(gTS·d),降低46.2%.经恢复后(阶段 Ⅲ),在70d 时HUR 降至0.315gCOD/(gTS·d),乙酸SMA 为0.030gCOD/(gTS·d),仍在降低.再经14d 稳定运行后(84d),HUR 为0.332gCOD/(gTS·d);乙酸SMA 得到恢复,为0.054gCOD/(gTS·d).

图5 比产甲烷活性变化Fig.5 Change of specific methanogenic activity

持续负荷冲击下的生物膜系统中,HUR 显著增加而乙酸SMA 降低.不断累积的VFAs 和增加的氢分压,抑制了嗜乙酸产甲烷菌对乙酸代谢而促进了嗜氢产甲烷菌对H2的利用,导致产甲烷途径进一步向嗜氢产甲烷转移.这与文献[29-30]结果一致,因系统中VFAs 积累以及不稳定的运行环境,不适应嗜乙酸产甲烷菌的生长所致.

2.3.2 INT-ETS 及辅酶F420浓度 如图6所示,稳定运行期间(阶段I),INT-ETS 活性略有降低,在28d时为2.47mmol/(gVSS·min).阶段Ⅱ中INT-ETS 活性逐渐增大,在56d 时达到3.35mmol/(gVSS·min),增加35.5%(与28d 相比).阶段 Ⅲ,INT-ETS 活性降低,在84d 时为2.88mmol/(gVSS·min).INT-ETS 活性指微生物呼吸链中电子传递速率,反映厌氧微生物活性[14].持续负荷冲击下系统中INT-ETS 活性提高35.5%,认为是分泌的EPS 中的电化学活性物质提高了电子转移的能力[28,31].研究表明[32],厌氧处理偶氮染料等难降解、高色度有机废水时,提高系统的电子传递速率可以促进污染物的高效厌氧降解.这也是持续负荷冲击下总多酚去除率下降不明显的原因.

图6 INT-ETS 活性及辅酶F420 浓度Fig.6 Changes of INT-ETS activity and coenzyme F420 concentration

阶段I,辅酶F420浓度略有增加,在28d 时,为559.08µmol/gVSS.负荷冲击下辅酶F420浓度也呈现增加的趋势;在56d 时,达到625.46µmol/gVSS,增加11.9%(与28d 相比).稳定运行后(70d)其浓度进一步增加,到达649.62µmol/gVSS;在84d 时浓度下降至632.45µmol/gVSS.辅酶F420由嗜氢产甲烷菌分泌,其浓度可反映产甲烷菌的数量或产甲烷活性[15].持续负荷冲击系统中HUR 明显增加,嗜氢产甲烷菌生长得到促进,这也是在负荷冲击结束后辅酶F420浓度继续增加的原因.此外,根据代谢活性与环境因子RDA 分析(图7)发现,HUR、辅酶F420与乙酸SMA呈负相关.HUR、INT-ETS 和辅酶F420与氢分压、乙酸和COD 浓度呈正相关,且HUR 与其相关性最强.系统中增加的氢分压在加快耗氢速率时,也提高了VFAs 降解的能量壁垒限制后续过程的进行[33],导致碱度被大量消耗,pH 值和系统稳定性降低.

图7 代谢活性与环境因子RDA 分析Fig.7 RDA analysis of metabolic activity and environmental factors

2.4 微生物群落结构

微生物群落结构在门水平上分布如图8a所示.其中,Proteobacteria(31.0%～42.1%)、Euryarchaeota(35.0%～51.3%)和Firmicutes(8.1%～10.2%)是主要的优势菌.与阶段Ⅰ相比,阶段Ⅱ中Proteobacteria、Firmicutes、Spirochaetes、Bacteroidetes 和Chloroflexi丰度减少,尤其是Proteobacteria,由42.1%降至31.0%;Euryarchaeota 丰度明显增加,由35.0%增至51.3%.阶段Ⅲ中Proteobacteria、Spirochaetes 和Chloroflexi丰度增加,Euryarchaeota、Firmicutes 和Bacteroidetes丰度降低.Proteobacteria、Firmicutes、Spirochaetes、Bacteroidetes 和Chloroflexi 是中温厌氧消化系统中常见的参与碳循环的发酵细菌,可将蛋白质和多糖等水解成VFAs 和乙醇等物质[5,14,29],负荷冲击后丰度降低,这将影响厌氧消化的水解和产氢产乙酸过程.Euryarchaeota 由产甲烷菌组成,在各阶段的丰度依次为35.0%、51.3%和50.4%,负荷冲击后其丰度得到明显增加,这说明微生物群落通过强化产甲烷过程来应对持续负荷冲击.

在属水平上的分布(图8b),Methanobacterium(32.2%～50.9%)、 Desulfovibrio(9.6%～19.4%)和Ruminococcus(5.2%～8.4%)为主要的优势菌属.负荷冲击后功能菌 Desulfovibrio、Ruminococcus、Geobacter 和 Syntrophobacter 丰度降低,其中Desulfovibrio 降幅最大,由 19.4%降至 9.6%.Desulfovibrio 可代谢乙醇或其他碳水化合物产氢产乙酸[14];Ruminococcus 属于Firmicutes 门,可以产生蛋白酶和脂肪酶等胞外酶降解蛋白质和脂类等底物,为产甲烷菌提供乙酸、H2和CO2[5,8,29];Geobacter为互营VFAs 降解菌,具备直接种间电子传递功能[14,31];Syntrophobacter 属于Proteobacteria 门,可与嗜氢产甲烷菌共生,是酒糟中主要的丙酸降解菌[34].系统中增加的VFAs 和氢分压阻碍了产氢产乙酸过程的自发进行,抑制了这类功能菌的代谢生长.同时,Methanobacterium丰度增加,由32.2%增至50.9%,嗜氢产甲烷途径占比得到进一步增加.阶段Ⅲ中Methanobacterium、Ruminococcus 和Syntrophobacter丰度降低,Desulfovibrio 和 Geobacter 丰度增加.Desulfovibrio 和Geobacter 具备DIET 能力,可与Methanobacterium 产甲烷菌建立DIET 产甲烷途径,在提高系统稳定性、促进VFAs 降解和增强产甲烷过程发挥重要作用[35].

持续负荷冲击下,抑制了产酸功能菌(Desulfovibrio 、 Ruminococcus 、 Geobacter 和Syntrophobacter)的 代 谢 ,但 促 进 了Methanobacterium 的生长.根据代谢活性与微生物群落相关性分析(图9)可知,Methanobacterium 与辅酶F420、HUR 和INT-ETS 呈正相关,这表明生物膜系统通过群落结构演替,促进还原CO2产甲烷途径来维持产甲烷过程的进行.负荷冲击结束后,利用菌属Desulfovibrio、Geobacter 和Syntrophobacter 与Methanobacterium 形成新的互营共生关系来维持代谢平衡.

图9 代谢活性与群落结构相关性Fig.9 Correlation analysis between metabolic activity and community structure

3 结论

3.1 持续负荷冲击期间,AnSBBR 在前13d(29～41d)可保持高的去除效果和运行稳定性.42～56d 反应器性能迅速下降,COD 去除率降至83.0%,氢分压增至739.7Pa,VFAs 为858.3mg/L,甲烷产量为15.7L/d;稳定性明显降低,pH 值低于7.0,VFA/TA 为0.72,VFA/BA 为1.29.经8d 稳定运行后反应器的性能重新恢复.

3.2 与稳定阶段相比(28d),在42d 时仅外层的Slime-EPS 浓度明显增加(34.1%);随负荷冲击时间增加,在56d 时TB-EPS 和LB-EPS 浓度分别增加61.3%和62.8%.同时,其PN/PS 比值也显著增加197.8%和126.0%.恢复运行中EPS 含量及PN/PS 快速恢复至原有水平.结合三维荧光发现,持续负荷冲击激发了保护机制,EPS 分泌大量的应急性蛋白类产物以应对环境胁迫.

3.3 与稳定阶段相比(28d),持续负荷冲击下(56d),生物膜系统中HUR 增加69.2%,乙酸SMA 降低46.2%,INT-ETS 活性增加35.5%,辅酶F420浓度增加11.9%.结合群落结构发现,嗜氢产甲烷菌(Methanobacterium)丰度由32.2%增至50.9%,生物膜系统通过促进还原CO2产甲烷途径来维持产甲烷过程.