用于诺氟沙星现场灵敏检测的便携式智能手机赋能荧光传感技术

卓雨欣,徐文娟,程 源,龙 峰(中国人民大学环境学院,北京 100872)

抗生素因其特有的优异性能而被广泛应用于人的抗感染治疗、家禽与水产养殖过程中疾病预防、治疗和促进生长等[1-4].常用抗生素包括喹诺酮类、磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类等,仅用于临床的抗生素就多达数百种.由于大多数抗生素类药物在人和动物机体内都不能够被完全代谢,所以常常以原药和代谢产物的形式经由粪尿排出而进入环境[2-4].抗生素在自然界化学稳定性很好,需要足够长的时间才能降解成其他物质,因此,环境中残留的抗生素可能通过各种方式重新进入人体,如喝含有抗生素的水、吃残留抗生素的肉类和蔬菜等.研究表明,不同国家和地区在地表水、地下水、土壤及沉积物,甚至饮用水源中均检出抗生素[5-7].据报道,我国儿童普遍暴露于低剂量抗生素中,许多在环境和食品中经常发现的抗生素在尿样中频繁检出[7-10].抗生素通过各种途径进入人体并积蓄后,不仅会使得人体产生过敏反应,而且可能对人体器官造成毒性损伤、损害神经系统,甚至可能导致“三致”效应.同时,抗生素在环境中的积累导致细菌的抗药性增强,耐药基因可通过环境、食物链等方式传播至人体;有的形成“超级细菌”,难以甚至不可能通过常规抗生素来治疗感染,严重威胁到人类的生命健康安全[9-11].

世界各国均对抗生素的使用提出了严格标准,欧盟的标准比日本和美国的标准更加严格,限量值更低.2022年,我国出台的《新污染物治理行动方案》和《重点管控新污染物清单》中,抗生素被列为重点管控的新污染物[13].为遏制抗生素的滥用和快速监测预警抗生素的危害,发展灵敏度高、选择性强、经济简便的抗生素现场快速定量分析新原理和新方法至关重要.

现有的抗生素检测方法包括色质联用法、微生物法和生物亲和分析法等[9,12-16].色质联用技术灵敏度高、准确性强,但仪器昂贵、程序复杂、检测成本高;而发展较早的微生物检测法需要进行细菌培养,耗费时间长、检测误差大,不适用于抗生素的现场即时定量检测.生物亲和分析法是利用生物亲和反应原理进行抗生素的检测,因具有分析速度快、特异性强、灵敏度高等显著优势而备受人们青睐.其中,基于免疫反应原理的光学生物传感技术既具备光学检测的高灵敏性,又具有生物亲和反应的高特异性,正在成为抗生素现场即时定量检测领域的一颗璀璨明珠[17-18].更为重要的是,融合智能手机的生物传感器因其具有智能化、便携化、高灵敏、高特异性等优势,正在成为环境监测领域的研究热点和前沿.

本研究通过融合激光诱导荧光原理和光纤传感原理,集成全光纤光学系统、微型化流动进样系统、高灵敏光电探测系统和基于智能手机的APP 软件,发展了用于水中NOR 现场快速灵敏检测的便携式智能手机赋能荧光生物传感器.结合间接竞争免疫分析机制,建立了用于NOR 现场快速定量检测的新方法,并用于各种水样中NOR 的灵敏检测.结合物联网等新兴技术,该仪器可根据设定的程序将检测结果直接上传环境监测监管中心,从而为实现水环境安全的监测预警和应急监测提供重要技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3-巯基丙基三甲基硅烷(MTS)、N-(4-马来酰亚胺基丁酰氧基)丁二酰亚胺(GMBS)、牛血清蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich(美国).浓硫酸、30%氢氟酸、盐酸、30%过氧化氢、甲苯、乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、二甲基砜(DMSO)、卡那霉素(Kanamycin,KANA)、氨卡西林(Ampicillin,AMP)均由北京化学试剂(中国北京)提供,试剂纯度均为分析纯.NOR 标准品、NOR 抗体均购自武汉纯度生物科技有限公司.氟虫腈(Fipronil,FIP)、啶虫脒(Acetamiprid,ACE)及其抗体由河北省科学研究院提供.磷酸盐缓冲液(PBS)(137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、4.3mmol/L Na2HPO4、1.4mmol/L KH2PO4,pH=7.4)、抗体稀释液(1.0g BSA、100mL 0.01mol/L PBS)和再生溶液(十二烷基硫酸钠,SDS,0.5%,pH=1.9)自行制备.

1.2 仪器:便携式智能手机赋能荧光生物传感器

如图1所示,仪器主要由全光纤光学系统、微型化流动进样系统、高灵敏光电探测系统等模块组成.其中,基于Y-型光纤耦合器的全光纤光学系统是微型荧光生物传感器小型化的核心.635nm 激发光经Y-型光纤耦合器的单模光纤进入光纤探头以全内反射方式传输,并在其表面形成有效渗入深度约为100nm 的倏逝波.倏逝波诱导通过亲和反应结合光纤探头表面的荧光标记生物识别分子发出荧光,部分荧光耦合回光纤探头,经Y-型光纤耦合器的多模光纤传输和滤光片滤除杂散光,由高灵敏光电探测器探测到并转换为可检测的电信号.Y-型光纤耦合器的使用最大限度地减少了光学分离元件,有效地提高光的传输效率,并极大地减少了仪器体积.

图1 便携式智能手机赋能荧光生物传感器Fig.1 Portable smartphone powered fluorescent biosensors

为提升仪器检测的自主性和智能化,研发了基于智能手机安卓平台的APP 软件.该软件主要包含仪器参数设置与控制、目标物实时检测、信息查询与传输、蓝牙连接等模块.智能手机通过蓝牙连接模块和modbus 协议操控便携式荧光生物传感器,该传感器的主控芯片接收来自智能手机的指令以实现目标物的检测,并将检测的光电信号等数据上传至智能手机.利用该APP,可实现荧光生物传感器的智能控制和检测的自主化,并用于检测信息的接收、处理和存储.

1.3 光纤探头的功能化

为用于NOR 的免疫分析,需要将光纤探头表面修饰包被抗原NOR-OVA.具体步骤如下:①光纤探针的锥型化,即将直径为600µm(NA=0.22,5.5cm)的石英多模光纤用氢氟酸腐蚀成组合锥形结构.②将其置于食人鱼溶液(H2SO4:H2O2=3:1)中浸泡30min后取出,超声清洗后烘干,此时,光纤探头表面形成羟基.③光纤探头硅烷化,即将羟基化的光纤探头置于体积比为2%的MTS甲苯溶液中在37℃条件下反应2h,使用甲苯清洗后用氮气吹干.④将硅烷化光纤探头浸于双功能试剂GMBS(20nmol/L)乙醇溶液中,反应1h,使用PBS冲洗.⑤包被抗原固定,即将光纤探头置入0.5mg/mL NOR-OVA 溶液中,4℃反应过夜.⑥将包被抗原功能化的光纤探头放入2mg/mL BSA 溶液中反应2h,以封闭光纤探头表面的活性位点.功能化光纤探头放入4℃下冷藏备用.

1.4 实际样品的预处理与检测

为评价便携式智能手机赋能荧光生物传感器及其检测方法的实用性和可靠性,对自来水、地表水和二沉池出水等实际水样进行NOR 加标回收实验,所有样品均平行检测3 次.

2 结果与讨论

2.1 基于便携式智能手机赋能荧光生物传感器的NOR 免疫分析原理

如图2所示,先将荧光标记NOR 抗体与样品混合预反应一段时间,样品中NOR 与部分荧光标记抗体结合.其结合量与样品中NOR 浓度成正比例关系.然后利用便携式荧光生物传感器内置的蠕动泵将混合液泵入样品池,含有自由结合位点的荧光标记抗体可与光纤探头表面的包被抗原发生免疫反应而结合到光纤表面.由于激发光在光纤探头内以全内反射方式传播,产生的倏逝波渗入深度仅为100nm 左右,因此,仅有结合到光纤表面的荧光标记抗体才能被激发,溶液中荧光标记抗体对检测结果影响很少.被激发的荧光部分耦合回光纤探头,最终由光电探测器检测并转化为可测量的电信号.电信号通过蓝牙模块实时传输至智能手机APP 软件并显示在用户界面(图2b).当样品中NOR 浓度越高,结合到光纤探头的荧光标记抗体量越少,检测到的荧光信号越低.根据荧光信号的强弱与样品中NOR 浓度的线性关系即可实现其定量检测.为重复使用光纤探头,使用0.5%的SDS(pH=1.9)溶液对光纤探头进行再生,洗脱结合到光纤探头的抗体,经PBS 缓冲液冲洗可进行循环使用.

图2 基于便携式智能手机赋能荧光生物传感器的NOR 免疫分析原理Fig.2 NOR immunoassay principle based on portable smartphone powered fluorescent biosensor

2.2 功能化光纤探头的性能表征

为验证NOR-OVA 功能化光纤探头的适用性,进行了以下对照实验.①将1.0µg/mL Cy5.5-NOR 抗体通入样品池反应5min,便携式荧光生物传感器检测到的荧光信号值约为98(图3a);②将1.0µg/mL Cy5.5 标记的氟虫腈抗体和啶虫脒抗体分别加入样品池,5min 后检测到的荧光信号值分别为10 和12,远小于NOR 抗体的荧光信号值,表明功能化光纤探头的非特异性吸附较小.③将1.0µg/mL Cy5.5-NOR抗体与6.0µg/L NOR 预反应5min 后,通入样品池反应5min,其信号响应值为39,相较于未加NOR 的实验荧光信号值有较大降低,但高于其他抗体的荧光信号值.以上结果表明,NOR-OVA 包被抗原被成功修饰到光纤探头表面,对NOR 抗体具有较好的特异性识别能力;结合间接竞争免疫分析原理,可以用于NOR 的定量检测.

图3 功能化光纤探针的性能表征Fig.3 Performance characterization of functionalized fiber optic probes

同时,测试了功能化光纤探头的可重复使用性能.结果显示,NOR-OVA 修饰的光纤探头可重复使用上百次,且其性能没有显著变化(图3b),其相对标准偏差(RSD)<4.5%.这不仅有利于提高检测的准确性,也可显著降低检测成本,单次检测成本<1 元/次.

2.3 NOR 免疫分析条件的优化

为在保障NOR 免疫分析性能的前提下,缩短检测时间,对预反应时间和免疫反应时间进行了优化.首先,将1.0µg/mL荧光标记的NOR抗体与2.0µg/mL NOR 混合(各30.0µL)分别反应0,1,3 和5min 后,加入样品池中反应5min,并检测其荧光信号值.图4a显示荧光信号值随着预反应时间的延长逐渐降低,当预反应时间超过5min 后,荧光信号值不再明显下降,表明荧光标记抗体与NOR 结合达到平衡.因此,最佳预反应时间为5min.

图4 NOR 免疫分析条件的优化Fig.4 Optimization of NOR immunoassay conditions

其次,当荧光标记的NOR 抗体与NOR 反应混合物加入样品池后,含有自由亲和位点的抗体会与光纤探头表面固定的包被抗原结合.随着结合的抗体量增加,便携式荧光生物传感器检测到荧光信号值逐渐增大.为缩短检测时间,将免疫反应时间定为5min,此时,可以检测到明显的荧光信号响应.虽然该荧光信号值未达到最大值,但是当免疫反应时间一定时,仪器检测到的荧光信号值与待测物浓度成比例关系,可用于其定量检测.

2.4 NOR 检测标准曲线的建立

为实现便携式荧光生物传感器对NOR 的定量检测,需要建立其检测标准曲线.为此,将NOR 储备液稀释至系列浓度(0.5,1.0,2.5,5.0,7.5,10.0,20.0 和50.0µg/L),与5.0µg/mL 的标记抗体等体积混合,预反应3min 之后将其通入样品池.在反应5min 后,检测其荧光信号强度(图5a).从图5a 可知,荧光信号值随NOR 浓度的增加而降低.这是由于样品中NOR 浓度的提高会使其结合更多的荧光标记抗体,导致结合到光纤探头的荧光标记抗体量减少,从而使得检测到的荧光信号值降低.检测完成后,使用0.5% SDS溶液对光纤探头进行再生.

图5 基于便携式智能手机赋能荧光生物传感器的NOR 检测标准曲线建立Fig.5 The standard curve of NOR based on portable smartphone powered fluorescence biosensor

对各种NOR 浓度的荧光信号值进行归一化处理后,依据logistics 模型,对归一化信号与NOR 浓度的关系进行拟合,得到NOR 定量检测的标准曲线(图5b).将最大信号值的20%～80%对应的浓度区间为动态线性检测区间,即NOR 的线性检测区间为1.6～20.6µg/L.NOR 的检测限为0.35µg/L.这些结果表明,便携式智能手机赋能荧光生物传感器对于NOR 的检测具有良好的灵敏度.

表1 比较了目前常用方法的特点,从中可以看出,基于便携式智能手机的倏逝波荧光检测方法相较于色谱,ELISA 等检测方法,具有无需预处理,检测快速简单且灵敏度高的优势,同时在成本等方面也具有明显优势[19].

表1 常见检测方法对比Table 1 Comparison of common detection methods

2.5 生物传感器的选择性

生物传感器的选择性是衡量其检测结果可靠性的重要指标之一.为此,分别将5.0µg/mL 的荧光标记NOR 抗体与10µg/L 诺氟沙星(NOR)、卡那霉素(KANA)、啶虫脒(ACE)、氨卡西林(AMP)等体积混合,预反应3min之后将其通入样品池.在反应5min后,检测其荧光信号强度.由图6 可知,只有在NOR 存在的情况下,检测信号才有明显下降;而当其他3 种干扰物存在时,其荧光信号基本与空白样品的检测信号一致,说明NOR 抗体具有良好的选择性,可以实现NOR的特异性检测.

图6 生物传感器的选择性Fig.6 Selectivity of biosensors

2.6 实际水样中NOR 的检测

为评估便携式智能手机赋能荧光生物传感器用于NOR 检测的实用性,使用建立的方法对地表水、自来水、地下水和二沉池出水进行了加标回收测试.由表2 可知,NOR 的加标回收率在85%～120%之间,相对标准偏差少于5%,这表明便携式智能手机赋能荧光生物传感器具有良好的准确性和稳定性,可以用于实际水样中NOR 的定量检测.在实际应用中,APP 软件设定不同样品中特定目标物的检出限,当实际检测结果高于检出限,即可预警检出结果异常,提示应采取进一步处理处置措施.

表2 便携式智能手机赋能荧光生物传感器用于水样中NOR 加标回收实验结果Table 2 Recovery rates of various spiked water samples using portable smartphone powered fluorescent biosensor

本研究仅考察了便携式荧光生物传感器用于NOR 的检测,为拓展其应用范围,可通过简单更换相应的光纤探头和荧光标记抗体,建立用于其他抗生素和环境污染物的高灵敏检测方法.因用于NOR 检测的抗体性能会受温度、pH 值等因素的影响,因此这些因素的变化可能会影响NOR 检测结果的准确性,后续将继续研究NOR 的优化检测条件.总的来说,由于智能手机和微型光学系统的使用,便携式智能手机赋能荧光生物传感器不仅可以实现NOR 的现场快速检测,而且可结合物联网等新兴技术,根据设定的程序将检测结果直接上传环境监测监管中心,为保障水环境安全的监测预警和应急监测提供重要技术支持.

3 结论

3.1 运用研发的便携式智能手机赋能荧光生物传感器,结合间接竞争免疫分析原理,建立了NOR 现场快速灵敏传感检测技术.

3.2 在优化条件下,便携式荧光生物传感器对NOR的检测限可达 0.35µg/L,线性检测范围为 1.6～20.6µg/L.

3.3 本研究所建立的NOR 检测方法可用于多种水样中NOR 的加标回收检测,其回收率为85%～120%,表明其可以用于实际水样中NOR 的快速检测,检测时间少于15min.