全氟烷基酸在大型溞体内的竞争富集作用及机制

肖 璐,张尚伟,程 浩,于丹凤,姜晓满,胡蝶旋,文 武*,夏星辉(.北京师范大学珠海校区理工实验平台,广东 珠海 59087；.北京师范大学环境学院水沙科学教育部重点实验室,北京 00875；.北京师范大学环境与生态前沿交叉研究院,广东 珠海 59087；4.中南林业科技大学环境科学与工程学院,湖南 长沙 40004)

全氟烷基酸(PFAAs)是一类人工合成的含氟有机化合物,作为一类碳链上的氢原子全部被氟原子取代的新污染物,PFAAs 通常是由其前体全氟及多氟化合物(PFAS)在环境中转化形成的稳定产物,因此被称为末端PFAS[1-2].由于以全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)为代表的典型长链PFAAs(全氟碳原子数超过6 个)具有优秀的理化特性,从20世纪50年代被广泛应用于生产生活的众多领域[3],致使其成为一类全球性有机污染物[4-6].研究发现,长链PFAAs 表现出肝脏毒性、生殖毒性、发育毒性和内分泌干扰效应等多种生物毒性效应和较高的生物累积潜力[6-8],并与人体疾病具有一定的相关性[6,9].因此,长链PFAAs 逐步在全球范围内被淘汰或限制生产和使用.但以全氟丁酸(PFBA)和全氟丁基磺酸(PFBS)为代表的碳链更短、功能相近的替代品开始被生成和使用,并在环境中被广泛检出,甚至成为环境介质中的主要PFAAs[10-14].据估计,在1951～2015年间全氟羧酸(C4～C14)的全球排放总量约为2160～21400t,而在2016～2030年间可能达到20～6420t[15].由于碳氟键极高的键能,导致这些污染物在环境中具有极强的生物稳定性.到目前为止,仍然没有有效的数据证明这些污染物可在自然环境中被生物降解[16-18].因此,长链和短链PFAAs 将在环境介质中普遍同时存在,然而有关这些污染物之间的相关作用对生物影响的研究仍然十分有限.

自2001年首次在野生动物中检测到PFAAs 以来[16,19],大量研究证明这些污染在世界各地(甚至偏远的北极地区和人迹罕至的青藏高原地区)各种野生动物中广泛存在,包括无脊椎动物(如浮游动物、贝类、虾类、片脚类等)、鱼类、鸟类、爬行动物、两栖动物和哺乳动物等[6,13,16,20-22].近些年来,这些PFAAs 在人体中有检出的报道也越来越多[23-26].然而,有关短链PFAAs 在生物体内检出频率和生物累积系数不高.研究发现,当长链和短链PFAAs 共存时,短链PFAAs 在斑马鱼体内的含量受到长链的明显抑制,且该作用随暴露时间等增加呈现先增强后趋于稳定的趋势[27].据此推测长链与短链PFAAs 的竞争富集作用可能是导致短链PFAAs 在生物体内检出率和生物累积系数相对较低的原因之一.虽然这种竞争富集作用在高等级的硬骨鱼体内有明显的表现,但在等级较低、生理结构相对较简单的浮游动物体内是否也有相似的现象目前还不清楚.

为了验证长链和短链PFAAs 在浮游动物大型溞(Daphnia magna)体内的竞争富集作用,本研究选择6 种典型长链PFAAs(包括C8～C12 全氟羧酸和PFOS)和5 种短链PFAAs(C4～C7 全氟羧酸和PFBS)作为目标污染物,以大型溞为实验对象,通过长链PFAAs 存在和不存在条件下的暴露实验比较,分析PFAAs 在大型溞体内生物富集动力学参数和生物浓缩系数与PFAAs 理化性质的相关关系,剖析长链PFAAs 对短链PFAAs 上述指标影响,探讨长链PFAAs 对短链PFAAs 生物富集的竞争富集作用及其相关机制,以期为全面厘清PFAAs 的环境行为和准确评价PFAAs 的生态环境效应及风险提供理论和数据支持.

1 材料与方法

1.1 实验材料

11 种目标污染物包括C4-C12 直链全氟羧酸以及全氟磺酸PFBS 和PFOS,纯度高于95%,购自Matrix Scientific Trade、Tokyo Chemical Industries以及Acros Organics 等公司.4 种回收率指示剂包括13C4-PFBA(MPFBA,99%)、13C4-PFOA(MPFOA,99%)、13C4-PFBA(MPFOS,99% 和13C4-PFDoA(MPFDoA,99%),购自Wellington Laboratories 公司.色谱纯甲醇和乙腈购自J.T.Baker of Phillipsburg 公司;甲基叔丁基醚(MTBE,99.5%)购自Acros Organics公司;四丁基硫酸氢氨(TBA,99%)购自百灵威公司;醋酸铵(色谱纯)、冰醋酸(色谱纯,>99.8%)和氨水(色谱纯,～50% v/v)购自Alfar 公司;超纯水(18.2MΩ)由Milli-Q Advantage A 10 系统(美国,Millipore)提供.0.22µm 尼龙滤膜购自Agilent Technologies 公司;Oasis WAX 6cc(150/500mg)固相萃取(SPE)柱购自Waters 公司.

1.2 实验设计

将用于污染物暴露实验的聚丙烯烧杯分成三组.第一组为对照组,暴露液中不添加任何PFAAs.第二组为短链PFAAs 暴露组,暴露液中添加5 种短链PFAAs,总浓度为50µg/L(每种PFAA浓度为10µg/L).第三组为5 种短链和6 种长链PFAAs 的暴露组,总浓度是110µg/L(每种PFAA 浓度为10µg/L).每个烧杯中放入300 只实验室培养的健康活泼的成年大型溞.生物富集实验持续14d.在整个暴露期内,每个烧杯中的暴露液在每天喂食2h 后完全更换,繁殖的幼溞捞出弃用.对照组和暴露组操作完全相同.对照组和暴露组每组均设置3 个重复.

在实验开始和结束以及暴露24h 的换水前、后,从每个烧杯中采集50mL 水样,用以监测暴露液中PFAAs 的实际浓度.在第1,3,7,12,24,36,48,72,120,168 和336h 分别从每个烧杯中采集10 只大型溞,用以分析PFAAs 在大型溞体内的含量.采集的大型溞立即用超纯水冲洗以除去采样时大型溞体表携带的暴露液,并置于滤纸上吸干大型溞体表水分,然后称量其湿重,置于5mL 聚丙烯离心管中匀浆以备后续分析.

1.3 样品前处理方法

暴露液中PFAAs 的萃取和净化采用固相萃取法进行样品的富集和净化,生物样品采用离子对法萃取,并结合固相萃取法进行净化[28].

1.4 仪器分析方法

样品中PFAAs 含量用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪测定.其中,液相系统为UPLC Nexera XR LC-20AD系列液相色谱仪(Shimadz,Japan),配备二元梯度泵和自动进样器,分离柱为 BEH C18(1.7µm,2.1mm × 100mm,Waters,USA).进样体积是2µL.流动相为水(含5mmol/L 乙酸铵)和甲醇,流速为0.2mL/min.流动相梯度淋洗程序为:初始甲醇比例为30%,持续1min,然后在4min 内上升至85%,接着在3min 内上升至100%并保持5min,然后在0.5min内回复到初始状态(30%甲醇)并稳定3min.质谱系统为AB 4500 三重四级杆串联质谱检测系统(Applied Biosystems 4500,Singapore),配备电喷雾离子源.使用多反应监测模式对PFAAs 进行定量分析.仪器离子源参数和质谱检测条件分别见表1、表2.

表1 ESI-MS/MS 离子源参数Table 1 Parameters of ion source for AB 4500 ESI-MS/MS

表2 质谱检测条件Table 2 MS detector condition for AB 4500

1.5 质量保证和质量控制

目标化合物的MQLs 定义为信噪比(S/N)的10倍,基于基质和完整的前处理程序计算获得,水样和生物样品的MQLs 范围分别为0.0093～0.063ng/L 和0.42～3.9ng/g.样品中PFAAs 的含量使用外标法定量,标准曲线线性范围为0～200µg/L.曲线相关系数均高于0.99.样品测定过程中,为避免背景污染和确保仪器稳定性,每测定10 个样品后插入1 个溶剂空白和1 个标准样品.当标准样品测定值与理论值相比超过±20%时,重新绘制标准曲线.为确保样品的萃取效率和测定的准确性,分别水样和生物样品进行加标回收率实验.结果表明,水样和生物样中不同碳链长度的 PFAAs 加标回收率分别为(75.2%±3.2%)～(105%±14.8%)和(77.5%±5.4%)～(101%±4.9%).换水前后暴露液中的PFAAs 浓度没有发生显著变化(P>0.05)(表3),这表明生物富集实验过程中暴露液浓度基本保持稳定.

表3 大型溞暴露液中全氟烷基酸浓度(µg/L)Table 3 Concentrations of PFAAs in the exposure water for D.magna(µg/L)

表4 不同条件下大型溞体内PFAAs 的动力学参数及生物浓缩系数(平均值±标准偏差,n=3)Table 4 Bioconcentration kinetic parameters and BCFss of shorter chain PFAAs in D.magna in the absence and presence of longer chain PFAAs(mean±SD,n=3)

2 结果与讨论

2.1 PFAAs 在大型溞体内的生物富集作用

2.1.1 只有短链PFAAs 暴露条件下,PFAAs 在大型溞体内的生物富集动力学参数与生物浓缩系数.如图1所示,无长链PFAAs时,短链PFAAs在大型溞体内的含量随暴露时间的增加先快速升高,最后在3～5d 左右达到稳定状态.根据各时间点短链PFAAs 在大型溞体内的含量,通过两箱动力学模型计算短链PFAAs 在大型溞体内的生物富集动力学参数[29-30]:

图1 PFAAs 在大型溞体内的富集动力学曲线Fig.1 Bioconcentration curves of PFAAs in D.magna

式中:Cb为大型溞体内的PFAAs 浓度,ng/gww;Cw为暴露液中PFAAs 浓度,ng/mL;ku0为组织中PFAAs 的吸收速率常数,L/(kgww⋅d);ke0为组织中PFAAs 的排出速率常数,d-1;下标“0”表示无长链PFAAs 暴露时的动力学参数.

生物富集动力学参数拟合结果如表 4所示.BCFss表示当短链PFAAs 在大型溞体内的生物富集达到稳定状态时,大型溞体内PFAAs 含量与暴露液浓度的比值.短链PFAAs 在大型溞体内的ku0和BCFss值均随全氟碳原子数的增加而增加,且呈显著线性正相关关系(图2).PFBS 的ku0和BCFss值均高于与其具有相同全氟碳原子数(C-F=4)的PFPeA,这与其他有关长链PFAAs 在水生生物体内生物富集的研究结果一致[28,31-32].这表明,PFAAs 自身理化性质对其在水生生物体内生物富集的影响相似,即全氟碳原子数和酸性基团类型是决定PFAAs 生物富集的重要因素.

图2 无长链PFAAs 时,全氟碳原子数与生物富集参数之间的相关关系Fig.2 Relationships between numbers of perfluorinated carbonand and bioconcentration factors in the absence of longer chain PFAAs

2.1.2 长链和短链PFAAs 共同暴露条件下,PFAAs在大型溞体内的生物富集动力学参数与生物浓缩系数.当长链PFAAs 存在时,长链和短链PFAAs 在大型溞体内生物富集曲线如图1所示.短链PFAAs在大型溞体内的含量先快速升高,达到峰值后开始下降,最终在第7d 左右达到稳定状态.短链PFAAs生物富集达到稳定状态所需的时间比没有长链存在条件下有所增加.这与长链和短链PFAAs 共同暴露时,短链PFAAs 在斑马鱼各组织中的生物富集曲线的变化规律相似[27].长链PFAAs 存在条件下,短链PFAAs 在大型溞体内的生物富集动力学参数计算分为2 个阶段:上升阶段和下降阶段.短链PFAAs 上升阶段和长链PFAAs 的生物富集动力学参数按式(2)计算:

式中:ku1[mL/(gww⋅d)]表示长链PFAAs 全阶段和短链PFAAs 在上升阶段的吸收速率常数;ke1(d-1)表示长链PFAAs 全阶段和短链PFAAs 在上升阶段的消除速率常数.下降阶段大型溞体内短链PFAAs 的生物富集动力学参数按式(3)计算:

式中:ku2[mL/(gww⋅d)]和 ke2(d−1)分别是存在长链PFAAs 暴露时短链PFAAs 在下降阶段的吸收速率常数和消除速率常数;Cpeak(ng/gww)和T(d)分别是短链PFAAs 在大型溞体内达到峰值的含量和时间,且t1

长链PFAAs 存在条件下,PFAAs 的动力学参数和 BCFss结果如表 4所示.可见,与只有短链PFAAs 暴露时相似,短链和长链PFAAs 在大型溞体内的ku1、ku2以及BCFss值均随全氟碳原子数的增加而增加,且呈显著线性正相关关系,但ke1与全氟碳原子数呈显著线性负相关关系(图3).全氟磺酸的上述指标都高于与其具有相同全氟碳原子数的全氟羧酸.

图3 长短链PFAAs 暴露下,生物富集动力学参数、生物浓缩系数与全氟碳原子数的相关关系Fig.3 Relationships between numbers of perfluorinated carbon,bioconcentration kinetic parameters and bioconcentration factors in the present of longer and shorter chain PFAAs

PFAAs 是一类同时具有疏水性碳氟链和亲水性酸性基团的污染物.研究认为,PFAAs 在生物体内的富集主要有2 种机制.一种是PFAAs 在细胞膜磷脂上的分配作用[18,33-35].该理论的基础是带电分子与磷脂的亲和力比中性分子相对更高[7,33,36-37].在生物体中,磷脂是组成生物膜的重要成分,构成了一个重要的与带电或部分带电分子非特异性结合的库.PFAAs 与磷脂的非特异性结合的强弱也与PFAAs 的全氟碳原子数相关,且随全氟碳原子数的增加而增加[38].基于该理论建立的可离子化有机物的生物富集预测模型可成功预测包括长链PFAAs在内的多种有机酸类物质在生物整体(非组织)中的生物浓缩系数[18].通过对PFAAs 在大型溞体内富集的ku和BCFss分别与辛醇-水分配系数和膜-水分配系数的相互关系分析发现,无论是只有短链PFAAs暴露(图4a～d),还是长链和短链PFAAs 共同暴露(图4e～h),上述指标与分配系数之间均呈显著正相关关系),这与其他研究结果一致[32,39].

图4 PFAAs 在大型溞体内的生物富集动力学参数、生物浓缩系数、辛醇-水分配系数和膜-水分配系数[32,40]的相关关系Fig.4 Relationships between octanol-water partition coefficients,membrane-water distribution coefficients,bioconcentration kinetic parameters,bioconcentration factors in the absence longer chain PFAAs

PFAAs 生物富集的另一种机制是PFAAs 与蛋白质之间的相互作用[6,41].研究认为PFAAs 与生物内源性脂肪酸具有形态和功能的相似性,能够激活某些基因、蛋白质和信号通路[42-46].大量研究已经证明PFAAs 能与多种生物的多种蛋白质结合,如血清白蛋白、肝脏脂肪酸结合蛋白、阴离子转运蛋白、甲状腺素转运蛋白以及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)α、β/δ、γ 等,并且它们之间的相互作用一方面对生物产生内分泌干扰效应,另一方面对PFAAs 的生物富集和组织分布有着重要作用[7,42,45,47-48].离体实验和基于分子对接的计算机模拟分析发现人类和鱼类蛋白质与PFAAs 的结合亲和力随全氟化碳原子数的增加而明显增强,但当全氟碳原子数超过9 后与蛋白质的结合系数明显降低[28,49].通过对PFAAs(C4～C9)在大型溞体内富集的ku1和BCFss分别同PFAAs 与蛋白质结合系数(Ka)的相互关系分析发现,ku1和BCFss分别与Ka呈显著正相关关系(图5).分子对接分析发现,当与肝脂肪酸结合蛋白结合时,PFAAs 的磺酸基与结合蛋白结合位点的氨基酸残基形成的氢键数比羧基多1 个[28,49-50],这可能是全氟磺酸在生物体中具有更高的吸收速率和生物富集能力的原因之一.

图5 长短链PFAAs 暴露下,PFAAs 在大型溞体内的吸收速率常数、生物浓缩系数与PFAA-蛋白质结合系数[28]的相关关系Fig.5 Relationships between PFAA-protein binding affinities,uptake rate constants and bioconcentration factors in the presence of longer and shorter chain PFAAs

2.2 长链PFAAs 对大型溞体内短链PFAAs 生物富集的影响

比较长链PFAAs 存在和不存在2 种条件下短链PFAAs 在大型溞体内的生物富集动力学曲线,发现长链PFAAs 存在时,其曲线明显更低,并在达到峰值后这种差距更明显.比较2 种条件下的动力学参数,发现长链PFAAs 存在条件下短链PFAAs的ku1和ku2均比无长链PFAAs 条件下的ku0低,且两者的降低比例随全氟碳原子数的降低而增加(表5).即PFAAs 碳链越短吸收速率常速降低程度越大.当富集达到相对稳定状态后,长链PFAAs 存在条件下的BCFss值也比无长链存在下有明显降低.这表明,长链PFAAs 对短链PFAAs 的吸收和生物富集有抑制作用.另外,ku2的降低比例比ku1大,这说明可能是随着暴露时间的增加,长链PFAAs在大型溞体内的富集量逐渐增加,短链PFAAs 在大型溞体内的吸收速率受到的抑制作用逐渐增强,导致短链PFAAs 在下降阶段ku2的降低比例大于ku1.

表5 长链PFAAs 存在条件下,大型溞体内短链PFAAs 吸收速率常数和生物浓缩系数(ku1、ku2 和BCFss)比无长链存在条件下的相关参数(ku0 和BCFss)降低的比例(%)Table 5 Decreased proportion of uptake rate constants and bioconcentration factors of shorter chain PFAAs in the presence of longer chain PFAAs in D.magna compared with those in the absence of longer chain PFAAs(%)

PFAAs 与蛋白质之间相互作用本质上是PFAAs 与蛋白质结合点位的氨基酸残基之间的相互作用,并且蛋白质的结合点位形成的“口袋”和PFAAs 碳链之间的疏水作用在PFAAs 的结合中起着关键作用[48,51].通过分子对接分析发现,PFAAs与蛋白质结合时,其全氟碳链延伸到蛋白质形成的疏水“口袋”内部,从而与其周围非极性的氨基酸残基形成疏水接触,其结合力大小具有全氟链长的依赖性[7,28,49-51].对PFAAs 与蛋白质结合的空间构象分析发现,短链 PFAAs,特别是 PFBA 和PFBS,由于其全氟碳链很短,整个分子几乎仅结合在袋口位置,发生疏水接触的氨基酸残基十分有限;但随着全氟碳链长度的增加,疏水性全氟碳链逐渐深入“口袋”内部,与更多的氨基酸残基发生疏水接触,增加其结合力[28].PFAAs 与蛋白质的竞争吸附实验发现,长链PFAAs 可取代蛋白质上吸附的短链PFAAs,且短链PFAAs 的全氟碳原子数越少取代作用越显著[28].因此,可以推测,长链与短链PFAAs 的竞争富集作用可能存在两条途径.一是PFAAs 在大型溞体内的吸收和排出过程中的竞争作用.二是PFAAs 进入大型溞体内后在贮存点位的竞争作用.当只有短链PFAAs 暴露时,PFAAs之间不存在竞争(或者短链PFAAs 之间的竞争作用很弱),每种PFAA 可以“自由”地被大型溞吸收、排出和累积在体内.但是在长链与短链PFAAs 共同暴露时,由于竞争作用,大型溞吸收、排出和累积短链PFAAs 时均受到长链PFAAs 的竞争,导致短链PFAAs 的ku1、ku2和累积量均比只有短链PFAAs暴露条件下的值更低.特别是随着暴露时间增加(下降阶段),长链与短链PFAAs 的竞争作用加剧,相对于只有短链PFAAs 暴露或长链和短链PFAAs共同暴露的上升阶段的短链PFAAs 的ku2、ke2和BCFss的降低比例更大.例如,暴露第7d,长链和短链PFAAs 共同暴露条件下,PFBA 的吸收速率ku1比只有短链PFAAs 暴露的ku0降低45%;暴露第14d,吸收速率降低65%.总体而言,竞争富集作用导致短链PFAAs 的吸收速率常数和稳定状态下的生物浓缩系数明显降低,分别为8%～65%和56%～80%.

可见,长链和短链PFAAs 在大型溞体内的生物富集存在竞争作用,而且这种作用随大型溞体内长链PFAAs 含量的增加而增强.这与此前研究的斑马鱼体内PFAAs 的生物富集作用相似[27].这表明,在复杂的自然环境中短链PFAAs 可能因污染物之间的竞争作用导致在生物体内含量水平和检出率降低.因此,在全面评价全氟碳链长度PFAAs 的生态环境效应和风险时不应该忽视污染物之间的竞争作用.

3 结论

3.1 PFAAs 在大型溞体内生物富集的吸收速率常数和稳定状态下的生物浓缩系数与全氟碳原子数显著正相关,且具有相同全氟碳原子数的全氟磺酸的吸收速率常数和生物浓缩系数明显高于全氟羧酸.

3.2 长链和短链PFAAs 在大型溞体内发生竞争富集,竞争强度随大型溞体内长链PFAAs 含量的升高而增强.竞争富集作用导致短链PFAAs 的吸收速率常数和稳定状态下的生物浓缩系数明显降低,分别为8%～65%和56%～80%.