四溴联苯醚通过溶酶体-内源性和外源性凋亡通路诱导褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)细胞凋亡

王钊宁,曹 赛,刘 倩,崔馨逸,周 斌,3,王 悠,3,周仲元*(.中国海洋大学海洋生命学院,山东 青岛 66003；.青岛市环境保护科学研究院,山东 青岛 66003；3.崂山实验室,山东 青岛 6607)

新污染物(ECs)是指尚未认定或尚未受法规规定,且对人类健康具有潜在危害的一大类新的污染物[1].我国就新污染物治理颁布文件《水污染防治行动计划》、《新污染物治理行动方案》中指出要加强“近海海域生态保护”,建立健全环境风险评估和管控.新污染物多溴联苯醚(PBDEs)是一类广泛使用的溴代阻燃剂(BFRs),其以添加剂的形式与母体松散地混合,因此极易从产品中释放,并通过水循环、大气循环等途径进入海洋环境中并广泛存在于海洋环境与海洋生物体内[1-2].由于PBDEs 具有亲脂性、生物蓄积性等特性,使其具有较强的慢性生物毒性,可对生物体的大脑、肝脏和肾脏等器官以及内分泌、神经、及生殖系统产生毒性作用[3-4].虽然很多国家拟定相关法案对PBDEs 的生产进行限制或直接禁止使用,由于PBDEs 化学性质的稳定以及在生物体内的蓄积性,目前仍在许多地区的海水、沉积物中以及海洋生物体内检测到不同水平PBDEs 的存在,并且PBDEs 水平保持着持续增长的趋势[5-6].2013年我国渤海27 条河流入海口检测到PBDEs 最高值为38ng/L,2017年最高值达238ng/L,是2013年的6 倍之多[7].而在对珠江三角洲和南海沉积物中PBDEs 的含量高达7340ng/g[8],在巴西海域的10 种鲸类体内,肝脏中的PBDEs 浓度高达5960ng/g[9].

褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)是一种重要的海洋浮游动物,在海洋生态系统物质循环和能量流动中起着重要作用.同时,褶皱臂尾轮虫具有在海洋中分布广泛、组织结构简单、生命周期短、对环境变化敏感性高等优势,是实验生态毒理学研究和环境基因组学研究中的模式生物[10].针对PBDEs对褶皱臂尾轮虫毒性效应的前期研究,揭示了其毒性效应主要表现在对褶皱臂尾轮虫的生长发育、摄食行为及生殖的损伤[11-12].本课题组前期研究初步发现PBDEs 中毒性较高的四溴联苯醚(BDE-47)能够通过线粒体凋亡通路诱导褶皱臂尾轮虫凋亡,证明ROS 所引起的氧化应激是造成BDE-47 对褶皱臂尾轮虫毒性效应的主要原因;同时发现褶皱臂尾轮虫在低浓度BDE-47 胁迫下的线粒体自噬现象,解释了褶皱臂尾轮虫在BDE-47 胁迫下生殖策略转变,以及个体死亡的可能原因[13].

自噬被认为是生物为应对一定环境扰动下的“促生存策略”[14].溶酶体是参与细胞自噬过程中的关键细胞器,是决定细胞命运的重要“决策者”.在低于生物耐受阈值的环境扰动下,细胞可通过激活自噬在受损细胞中形成自噬小体将受损的细胞器、蛋白质运至溶酶体,在溶酶体酶的作用下消化、降解而重新利用[15],而研究表明,当溶酶体受损伤时,自噬活动受到抑制,最终触发细胞凋亡[16].在前期研究中我们在低浓度BDE-47 胁迫下的轮虫中发现自噬现象,表明轮虫通过线粒体自噬作用清除受损的线粒体;而在高浓度BDE-47 胁迫下,褶皱臂尾轮虫体内的受损线粒体无法通过自噬清除而激活凋亡[13],其原因是否与溶酶体损伤有关?由于溶酶体受损而导致凋亡的机制又是什么?据此本研究在课题组前期研究的基础上运用转录组学技术进一步研究BDE-47 胁迫褶皱臂尾轮虫的毒性效应,以溶酶体为切入点,更全面、精准地阐明褶皱臂尾轮虫受BDE-47 胁迫的响应途径和机制.

1 材料与方法

1.1 实验材料

受试生物褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)由休眠卵孵化.孵化条件:温度为(25±1)℃,光照强度为1000～1200lx,光暗周期为12h:12h,饵料为小球藻(Chlorella sp.).孵出的轮虫在光照培养箱中继续驯化两周,期间定时投喂小球藻,小球藻的密度控制在1×106m/L,轮虫的密度控制在10ind/mL.饵料小球藻在三角烧瓶中培养,接种时加入f/2 培养基并定时摇动烧瓶,防止小球藻贴壁和下沉.小球藻的培养条件除温度((20±1)℃)外,其余条件同褶皱臂尾轮虫.

四溴联苯醚BDE-47(纯度>99.99%,固体粉末)购自美国AccuStandard公司,二甲基亚砜DMSO(GC级)购自美国Sigma 公司,Cathepsin L 抑制剂(纯度≥98.0%,固体粉末)购自MedChemExpress 公司.

海水取自青岛即墨鳌山湾附近海域,使用前经0.45µm 滤膜过滤后高压灭菌(121.3℃,0.105MPa,20min),灭菌后的海水盐度为30‰,pH 值为8.6.

BDE-47 储备液(2mg/L)配制:取5mg BDE-47,加入2.5mL DMSO 将其溶解,室温避光保存,使用时用新鲜灭菌海水稀释成所需浓度.

ROS 荧光探针DCFH-DA(S0033S)购自碧云天生物技术限公司.取1mmol/L 的DCFH-DA 探针用PBS 稀释为10µmol/L 的工作液,-20℃保存.

吖啶橙(AO)荧光染色试剂盒(CA1142)购自北京索莱宝科技有限公司.

Cathepsin L 抑制剂储备液(1mmol/L)配制:取1mg Cathepsin L 抑制剂,加入2.8mL 新鲜灭菌海水将其溶解,-20℃保存,使用时用新鲜灭菌海水稀释成所需浓度.

1.2 转录组测序与分析(RNA-seq)

参与转录组测序的轮虫共有2 组:空白对照组和BDE-47(0.08mg/L)处理组,每组3 个平行,每个平行约有10000 只轮虫(约0.2g).胁迫期间不投喂小球藻.

胁迫24h 后收集轮虫,用Trizol 试剂(Thermo Fisher Scientific 公司)提取轮虫的总RNA.RNA 质检合格后进行cDNA 文库的制备,文库通过Agilent 2100 生物分析仪进行质检,质检合格后,用Illumina HiSeq2000 高通量测序平台对cDNA 文库进行测序,得到大量的原始读序(raw reads).对下机的raw reads利用fastp软件进行质控,过滤低质量数据,得到clean reads.使用Trinity 软件对clean reads 进行组装,获得Unigenes;通过blastx 软件将Unigenes 序列比对到蛋白数据库Nr、SwissProt、KEGG 和COG/KOG(e value<0.00001),获得Unigenes 的蛋白功能注释信息;使用Bowtie 和eXpress 软件对Unigenes 表达水平进行定量;使用DESeq 软件进行差异基因分析,设定P value<0.05,|log2(foldchange)|>1 的基因为差异基因(DEGs);对差异表达基因进行GO 和KEGG 富集分析,以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通 路.

1.3 DEGs qRT-PCR 验证

根据GO 和KEGG 富集分析结果,我们筛选了显著性富集通路中关键的DEGs 进行qRT-PCR 验证.应用Perl Primer 软件设计引物(表1),以RNA-seq样品的cDNA 为模板,以β-actin 为内参,采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 试剂盒(南京Vazyme 生物科技有限)实施qRT-PCR 反应.反应体系(10µL):cDNA 模板 1µL,正、反向引物各 0.2µL,ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5µL,Nuclease-free H2O 3.6µL.反应条件:95℃,30s;[95℃,10s;60℃,30s],重复40 个循环;从60℃缓慢升温至97℃,每1℃采集5次荧光信号.利用 Roche LC480Ⅱ荧光定量PCR 仪进行荧光定量检测,数据采用2-ΔΔCt法进行分析.

表1 DEGs qRT-PCR 验证的引物序列Table 1 Primer sequence verified by DEGs qRT-PCR

1.4 溶酶体膜损伤检测

从培养的轮虫中选取活泼健壮的成年褶皱臂尾轮虫40 只,随机分为空白对照组(灭菌海水)、溶剂对照组(0.04mL/L DMSO)、 BDE-47 处理组(0.08mg/L),每组10 只置于24 孔细胞培养板中.胁迫24h 后,加入5µg/L 的AO 染料,避光条件下震荡混匀并置于37℃恒温培养箱中孵育20min.将染色后的褶皱臂尾轮虫放入PBS 中冲洗,置于载玻片上,用荧光显微镜(Olympus IX-71)对其进行观察拍照,正常轮虫均匀染成绿色荧光,溶酶体膜损伤轮虫出现致密浓染的黄绿色颗粒或凸起.

1.5 ROS 荧光变化观察

轮虫的选取、收集、胁迫同1.4.胁迫24h 后,加入DCFH-DA染色工作液0.5mL,避光条件下震荡混匀并置于37℃恒温培养箱中孵育20min.将染色后的褶皱臂尾轮虫放入PBS 中冲洗,置于载玻片上,用荧光显微镜(Olympus IX-71)对其进行观察拍照.

1.6 凋亡通路上关键因子的测定

将褶皱臂尾轮虫随机分为空白对照组(灭菌海水)、溶剂对照组(0.04ml/L DMSO)、BDE-47 处理组(0.08mg/L BDE-47)和 Cathepsin L 抑制组(50µmol/L Cathepsin L 抑制剂+0.08mg/L BDE-47)4 组,每组3 个平行,每个平行约有10000 只轮虫(约0.2g).胁迫24h 后,收集轮虫,冰浴下超声破碎(工作5s,间歇15s,工作8 次),破碎后的匀浆4℃,2500r/min,离心10min 取上清.测定上清的总蛋白含量(BCA 蛋白含量测定试剂盒,碧云天)、Cathepsin L 活性(Cathepsin L 酶联免疫分析试剂盒,纪宁)、促凋亡因子Bax 含量(Bax 酶联免疫分析试剂盒,纪宁)、抗凋亡因子Bcl-2 含量(Bax 酶联免疫分析试剂盒,纪宁)、Caspase-3 活性(Caspase-3 活性检测试剂盒,碧云天)、Caspase-8 活性(Caspase-8 活性检测试剂盒,碧云天)和Caspase-9 活性(Caspase-9 活性检测试剂盒,碧云天).

1.7 数据统计与分析

采用统计软件SPSS 17.0 对数据进行统计分析,数据以平均值±标准差(n=3)表示,通过单因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比较(LSD)进行组间差异的显著性评估,P<0.05 的差异被认为是显著的.

2 结果与分析

2.1 BDE-47 胁迫下褶皱臂尾轮虫的差异基因分析

对褶皱臂尾轮虫6 个样本进行转录组测序后,共得到40.23Gb 的Clean Data,每个样本的Clean Data 均达到6.38Gb,碱基百分比Q30 均大于93.4%,说明测序准确度高,可用于后续分析.以对照组褶皱臂尾轮虫转录本为参考,对转录组数据进行比较,BDE-47 处理后共获得 582 个差异表达基因(P<0.05,log2(FC)>1),其中上调表达基因84 个,下调表达基因498 个,基因的下调水平明显高于上调水平(图1).

图1 差异表达基因的分析Fig.1 Analysis of differentially expressed genes

为了进一步研究响应BDE-47 胁迫的差异表达基因所参与的代谢途径,对582 个差异表达基因结合基因数目、富集因子和q 值分析,进行了KEGG功能注释和pathway 显著性富集分析,结果表明(图2、表2)差异基因显著富集于核糖体(ko03010)、MAPK 信号通路(ko04010)、细胞凋亡(ko04210)、雌激素信号通路(ko04915)等途径中,这些信号通路主要作用是参与调控细胞凋亡.其中,在核糖体中,共有60个差异性基因,且均显著性下调.在MAPK信号通路中,共有10 个差异性基因,1 个上调基因,9 个下调基因.在细胞凋亡通路中,共11 个差异性基因,2 个上调基因,9 个下调基因.在雌激素信号通路中,共15个差异性基因,均为下调基因.

图2 差异表达基因KEGG 通路富集分析Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

表2 显著富集通路Table 2 Significantly enriched pathways

通过GO 富集对上述显著性富集通路中的一些关键基因进行分析发现,关键基因核糖体基因rps3、rps9、hsp70、cam 呈显著性下调;cacn、pod、ctsl和cyt c 呈显著性上调(表3),且这些关键基因均与凋亡调控相关.对部分关键差异基因进行荧光定量PCR 验证,结果表明BDE-47 抑制褶皱臂尾轮虫钙调蛋白CaM、热激蛋白HSP 70 基因的表达,诱导类组织蛋白酶Cathepsin L 和过氧化物酶POD 基因的表达(图3).qRT-PCR 与转录组测序结果在基因表达趋势一致,说明转录组测序结果可靠.

图3 差异表达基因的qRT-PCR 验证Fig.3 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

表3 KEGG 通路中的关键差异表达基因Table 3 Key DEGs in KEGG pathways

2.2 BDE-47 胁迫造成褶皱臂尾轮虫溶酶体损伤

为了研究溶酶体膜稳定性,采用AO 染色法进行检测.AO 染色结果显示(图4):对照组中的轮虫呈均匀绿色荧光,与对照组相比,BDE-47 处理组褶皱臂尾轮虫的出现橘红色荧光颗粒,表明BDE-47 胁迫使得褶皱臂尾轮虫细胞溶酶体膜受到了损伤,溶酶体膜稳定性降低,通透性增强.

图4 BDE-47 胁迫下褶皱臂尾轮虫体内AO 荧光变化Fig.4 Changes in AO fluorescence in rotifers under BDE-47stress

图5 BDE-47 胁迫下褶皱臂尾轮虫体内Cathepsin L 含量Fig.5 Cathepsin L content of B.plicatilis under BDE-47 exposure

2.3 Cathepsin L 参与褶皱臂尾轮虫凋亡

为明确Cathepsin L 在BDE-47 诱导轮虫凋亡过程中的作用,使用50µmol/L Cathepsin L 抑制剂与 BDE-47 共同胁迫轮虫,与空白对照组相比,BDE-47 单独处理组中轮虫体内的Cathepsin L 含量显著上升(图 5)(P<0.05),而在 50µmol/L Cathepsin L 抑制剂与 BDE-47 共同处理组中,Cathepsin L 含量显著低于处理组(P<0.05),证明50µmol/L 的Cathepsin L 抑制剂能够有效抑制Cathepsin L.

在确定Cathepsin L 抑制剂的有效浓度后,对轮虫体内促凋亡因子Bax 和抗凋亡因子Bcl-2 含量测定,结果显示,与空白对照组相比,BDE-47 处理组中轮虫的Bax 含量显著上升(P<0.05);与BDE-47 处理组相比,加入Cathepsin L 抑制剂后褶皱臂尾轮虫体内的Bax 含量显著降低(P<0.05)(图6A).相反,与空白对照组相比,BDE-47 处理组中褶皱臂尾轮虫体内的抗凋亡因子Bcl-2 含量显著降低(P<0.05);加入Cathepsin L 抑制剂后褶皱臂尾轮虫体内的Bcl-2 含量显著上升(P<0.05)(图6B).通过计算Bax/Bcl-2 的比值可以发现,与空白对照组相比,BDE-47 处理组中Bax/Bcl-2 的比值是显著上升(P<0.05)(图6C).在加入Cathepsin L 抑制后,Bax/Bcl-2 的比值显著降低(P<0.05).

Caspase-3、-8、-9 含量的实验结果如图7所示:与空白对照组相比,BDE-47 处理组中轮虫的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 含量均有显著上升(P<0.05).在加入 Cathepsin L 抑制后,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 含量明显降低(P<0.05).表明BDE-47 引起的Cathepsin L 释放是导致褶皱臂尾轮虫凋亡的主要原因.

2.4 BDE-47 胁迫对褶皱臂尾轮虫ROS 水平的影响

经DCFH-DA 染色后,于荧光显微镜下观察发现,在对照组中(图8A,B),褶皱臂尾轮虫体内荧光较弱,说明ROS含量处于较低水平;而在0.08mg/L处理组中(图 8C,D),可观察到明显的绿色荧光.说明BDE-47 胁迫能够导致轮虫体内ROS 含量的升高.

图8 BDE-47 胁迫下褶皱臂尾轮虫体内ROS 荧光变化Fig.8 Changes in ROS fluorescence in rotifers under BDE-47stress

3 讨论

由大气沉降、江河径流等途径进入海洋环境中的PBDEs 可被浮游食物网中的浮游植物、浮游动物、草食性或肉食性动物等所直接利用.过去关于PBDEs 对褶皱臂尾轮虫的毒性效应的研究主要集中于种群数量、个体表型及行为等方面,但关于毒性效应的机制研究仍然不够深入和全面.本研究在前期研究的基础上继续以模式生物褶皱臂尾轮虫为研究对象,利用转录组技术分析BDE-47 胁迫24h 后体内的差异基因.研究发现在GO 富集上,轮虫经胁迫后,在免疫系统、信号转导、细胞器及抗氧化系统有关条目中存在大量差异基因的富集.这些差异基因在核糖体、细胞凋亡、MAPK 和雌激素信号等KEGG 代谢通路上显著富集.在核糖体相关功能基因中,核糖体蛋白(RP)基因显著下调.RP 是位于核糖体小亚基上的蛋白质,在DNA 修复、细胞凋亡等细胞事件中起重要调控作用,RP 的缺乏会导致核糖体和蛋白质的合成减少.研究表明缺少rps6 的小鼠在部分肝切除手术后,肝细胞无法正常增殖[17].在人类及高等哺乳类动物中的研究表明核糖体蛋白S3(RPS3)能够在线粒体积累,修复DNA 损伤[18-19];rps9 表达被抑制后,骨髓瘤细胞凋亡加剧、细胞周期阻滞[20].在本研究中,转录组结果显示RPS3、RPS9等核糖体蛋白显著下调,说明轮虫受到胁迫后细胞的生长、增殖、蛋白质翻译发生异常.除核糖体代谢通路有明显变化外,本研究发现在涉及雌激素代谢通路中的关键基因cam 在BDE-47 胁迫下表达显著下降.雌激素是具有广泛生物学活性的类固醇激素,具有促进细胞增殖、分化,抑制细胞凋亡的作用[21].MAPK 是在细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶.研究表明MAPK 能够参与细胞增殖、免疫、凋亡等一系列生物进程中[22].Vilatoba 等[23]在研究中发现,雌激素能够通过激活p38β 抑制p38α 改善缺血再灌注损伤后的细胞存活.此外,雌激素可以通过促进细胞内Ca2+转运,增加细胞内Ca2+浓度和cam 的基因表达,激活Wnt/Ca2+信号通路,加快细胞增殖分化[24].本研究在显著富集通路中发现cam基因的表达下降,表明BDE-47 胁迫抑制了轮虫体内雌激素代谢通路;凋亡通路和诱导凋亡的经典MAPK 信号通路中的关键基因cyt c 和cacn 的表达量在BDE-47 胁迫时出现显著上调,说明BDE-47 的胁迫能够诱导轮虫的凋亡.这可能与轮虫在受到BDE-47 胁迫时促进细胞增殖分化的雌激素通路受抑制相关.

溶酶体是细胞内主要的消化中心,能有效降解蛋白质、脂肪等生物大分子物质,且细胞内未折叠或错误折叠的蛋白主要通过自噬途经被捕获至溶酶体内进行降解[25-26].Cathepsin L 是存在于溶酶体内的凋亡介质,可以通过凋亡相关通路参与细胞凋亡.当溶酶体膜完整性受损时可以导致Cathepsin L 释放,进而导致细胞凋亡[27-28].Du 等[29]的研究表明,使用Cathepsin L 抑制剂可减少大鼠大脑动脉缺血后的组Cathepsin L 表达,降低胞浆中细胞色素C 含量及 Caspase-3 活性,表明 Cathepsin L 可能位于Caspase 信号的上游,调控Caspase 介导的细胞凋亡.通过对凋亡通路相关差异基因的转录组学分析以及qPCR 荧光定量验证,我们发现Cathepsin L 在BDE-47 胁迫后表达量呈显著性上升.因此推测轮虫体内的溶酶体可能是BDE-47 胁迫的靶器官,在BDE-47 胁迫下,轮虫体内的溶酶体受到损伤,受损伤的溶酶体一方面释放出大量的Cathepsin L,激活凋亡信号通路;另一方面,由于溶酶体损伤导致其功能受损,无法消化降解由核糖体产生的错误异常蛋白质,最终导致细胞凋亡.

通过AO 染色发现经BDE-47 胁迫的轮虫体内溶酶体膜受到显著损伤,通透性增强.qPCR 荧光定量发现抑制溶酶体膜通透性升高从而起到稳定溶酶体膜作用的关键蛋白HSP70 和在启动溶酶体修复机制中起关键作用的cam 基因表达显著降低,进一步证明轮虫体内的溶酶体在BDE-47 胁迫下结构严重破坏,且损伤无法修复逆转,最后破裂释放组Cathepsin L.为进一步验证我们的推测,探究溶酶体损伤与轮虫凋亡的关系,我们通过对内源性凋亡通路,即线粒体通路的Bcl-2 家族调控蛋白和Caspase级联反应中的关键凋亡蛋白进行测定,结果发现BDE-47 胁迫会引起褶皱臂尾轮虫的促凋亡因子Bax 表达量的升高以及抗凋亡因子Bcl-2 表达量的降低,导致Bax/Bcl-2 的比值上升,表明BDE-47 的胁迫诱导褶皱臂尾轮虫凋亡,同时也说明内源性凋亡通路被激活;而在加入 Cathepsin L 抑制剂后,Cathepsin L 得到有效的抑制,同时凋亡因子Bax/Bcl-2 比率、Caspase-3、-9 蛋白表达受到显著抑制,证明溶酶体受损伤引发的Cathepsin L 释放,是诱导轮虫凋亡通路响应的重要因素之一.此外,我们发现外源性凋亡通路,死亡受体通路中的关键蛋白Caspase-8 蛋白表达显著升高.Caspase-8 在死亡受体通路中可在肿瘤坏死因子(TNF-α)与细胞膜表面的肿瘤坏死因子(TNFR)结合后引起受体互作蛋白激酶(RIPK)活化,诱导凋亡发生[30-31].在加入Cathepsin L抑制剂后,Caspase-8蛋白表达受到抑制,证明溶酶体损伤能够同时引起内源性、外源性凋亡通路介导的凋亡.

活性氧(ROS)是细胞呼吸和细胞在外界因素胁迫下产生的由自由基和非自由基氧化的分子,参与到细胞增殖,凋亡,基因转录和表达的调节.当ROS过量产生时能够分别激活内源性和外源性凋亡通路诱导细胞凋亡[32-33].例如,在Hela 细胞中,过量的H2O2能够使线粒体膜电位去极化,释放Cyt C,引发caspase 联级反应,通过线粒体通路诱导凋亡[34].在小鼠肠外上皮细胞中,过量的H2O2能够上调位于细胞表面的死亡因子FasL 和其受体Fas 并通过FADD活化caspase-8,激活死亡受体通路诱导凋亡[35].溶酶体是铁的主要储存场所之一,溶酶体中游离的铁离子可以通过芬顿反应产生ROS,当溶酶体膜破坏时,会导致大量ROS 释放,是引发凋亡的另一种机制[36].过氧化物酶(POD)是抗氧化酶之一,在体内ROS含量过多时,能够激活体内抗氧化系统,使得POD 的升高.在本研究中发现在BDE-47 胁迫下,轮虫体内的表征ROS 含量的荧光显著增强,表明ROS 含量的显著上升,同时轮虫体内POD 蛋白表达升高,进一步证明轮虫体内的ROS 的过量产生.据此,我们认为溶酶体受到损伤后释放出ROS 是溶酶体受损引发轮虫凋亡的另一种方式(图9).

图9 BDE-47 诱导褶皱臂尾轮虫细胞凋亡机制Fig.9 The mechanism of BDE-47 inducing apoptosis in rotifers

4 结论

4.1 BDE-47 胁迫下,核糖体、雌激素通路、MAPK通路、凋亡通路等差异基因富集较显著.

4.2 证明“溶酶体损伤-组织蛋白酶释放-由经典凋亡途径诱导细胞凋亡”这一过程,初步探究褶皱臂尾轮虫Cathepsin L 的作用.本研究结果为进一步研究PBDEs 的毒性效应途径和机制提供了新思路.

4.3 溶酶体受损释放出大量的ROS 是诱导轮虫发生凋亡的另一种方式.