基于网络药理学和分子对接预测桃红四物汤治疗黄褐斑的机制

谢雨莎 张鹏程 田黎明1,,4* 柯 丹

（1.湖北中医药大学，湖北 武汉，430065；2.华中科技大学同济医学院附属武汉中西医结合医院皮肤科，湖北 武汉，430022；3.武汉市第一医院皮肤感染和免疫湖北省重点实验室，湖北 武汉,430022；4.湖北中医药大学老年医学研究所，湖北 武汉,430065；5.重庆市中医院皮肤科，重庆，400000）

黄褐斑是一种发生于皮肤光暴露部位的慢性色素沉着性疾病，目前认为遗传易感性、光暴露、性激素水平变化等是最主要的致病因素，但其具体发病机制尚不明确，仍需进一步探索[1]。黄褐斑的治疗以减少黑色素生成、消除炎性反应、抑制血管增生、修复皮肤屏障、抗光老化为指导原则[2]。由于单一治疗疗效欠佳，目前常采用多手段联合治疗，其中加用中药口服治疗疗效可观[3-5]。桃红四物汤是活血化瘀代表方，具有扩张血管、抗感染、降脂、补充微量元素等作用[6]。目前已有研究证明，桃红四物汤可以改善患者黄褐斑皮损状况，但其具体作用机制还需要进一步研究[7]。生物信息学分析相较于基础实验更加简便易行，是临床研究中常用的分析手段，本研究拟采取网络药理学方法构建药物活性成分互作网络，应用分子对接技术预测药物主要活性成分与疾病核心靶点之间的结合强度，以期寻找桃红四物汤治疗黄褐斑的核心靶点及相关通路，初步揭示桃红四物汤治疗黄褐斑的潜在分子机制，为中药复方治疗黄褐斑的临床应用提供一定的理论依据。

1 方法

1.1 桃红四物汤活性成分及靶点筛选

利用中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索桃红四物汤中有效成分，以“桃仁、红花、熟地黄、白芍、当归、川芎”为检索词。根据药代动力学原理，以药物口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 为标准筛选出药物有效成分并收集对应靶点。以下五个数据库用于收集活性化合物的靶标：TCMSP 数据库，Swiss Target Prediction 数据库，SymMap 数据库，GeneCards 数据库，STITCH 数据库，比较毒理基因组学数据库（CTD）。利用UniProt 数据库将靶点转换为对应的靶基因，查询不到的靶点通过PubChem 数据库查询SMILES 号后进行预测，最后删除最终仍无对应基因名的靶蛋白。

1.2 疾病靶点筛选

以“melasma”“chloasma”为关键词，通过Drugbank数据库、GeneCards 数据库、OMIM 数据库、TTD 数据库、DisGeNET 数据库筛选黄褐斑相关疾病基因靶点，汇总并删除重复基因。

1.3 蛋白互作网络（PPI）构建

将桃红四物汤靶基因和黄褐斑靶基因导入微生信平台，绘制韦恩图。将两者交集靶点导入STRING 数据库进行靶基因间蛋白互作分析，物种限定为Homo sapiens，设定置信度＞0.4 代表两个蛋白间有互作关系，构建PPI 网络图。导入Cytoscape 3.9.1 软件，利用工具CytoNCA 分析各靶点之间的作用关系，以网络中各靶基因的节点连接度值（Degree）为指标，筛选出网络中的关键蛋白。

1.4 构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络

基于桃红四物汤活性成分与黄褐斑靶点之间的相互作用关系，通过Cytoscape 3.9.1 软件构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络。以网络中各靶基因的节点连接度值（Degree）为指标，筛选出前10 位中药活性成分。

1.5 GO 分析与KEGG 富集分析

使用Metascape 数据库对交集基因进行GO 富集分析和KEGG 富集分析。按P 值升序排序，对GO 分析中的生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）均取前10 个条目，KEGG 富集结果选择前20 个条目，制作成气泡图做可视化处理。

1.6 分子对接

从PDB 数据库下载PPI 网络中核心蛋白的pdb 格式文件，再从PubChem 数据库下载网络图中Degree 值前10 的药效分子的sdf 格式文件。利用AutoDockTools 1.5.7 软件进行格式转化后进行分子对接模拟，再用PyMol 2.5.4 对接结果进行可视化处理。

2 实验结果

2.1 桃红四物汤活性成分及靶点筛选

通过TCMSP 数据库检索到桃红四物汤中成分730 个，其中桃仁66 个，红花189 个，熟地黄76 个，白芍85 个，当归125 个，川芎189 个，以“OB≥30%和DL≥0.18”为条件筛选并剔除无对应靶点的成分后，得到桃红四物汤有效成分共58 个，见表1。从TCMSP 数据库、Swiss Target Prediction 数据库、SymMap 数据库、GeneCards 数据库、STITCH 数据库、CTD数据库中筛选出作用靶点，去重后经UniProt 数据库查询简化得到桃红四物汤靶点基因11 139 个。

表1 桃红四物汤有效成分及编号

2.2 疾病靶点筛选

在Drugbank 数据库、GeneCards 数据库、OMIM 数据库、TTD 数据库、DisGeNET 数据库以“Melasma”“Chloasma”为关键词，筛选并去重后收集到黄褐斑靶点基因55 个。

2.3 蛋白互作网络（PPI）构建

将桃红四物汤的11 139 个靶点和黄褐斑的55 个靶点输入微生信平台，绘制韦恩图，两者交集为桃红四物汤活性成分与黄褐斑的共同靶点，共53 个，见图1。图中粉色代表桃红四物汤活性成分靶基因，绿色代表黄褐斑靶基因，二者交集为桃红四物汤活性成分-黄褐斑共同靶基因。将筛选出的交集靶点基因导入STRING 数据库进行蛋白互作分析，构建PPI 网络图，见图2。PPI 网络图中节点表示蛋白质靶点，每条边则表示蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系，网络中共53 个节点，191 条边，节点平均度为7.21。通过Cytoscape 3.9.1 软件绘制桃红四物汤-黄褐斑核心靶基因PPI 网络图，见图3，其中ALB、VEGFA、CD4、ESR1、CREB1 是桃红四物汤作用于黄褐斑的核心靶点。

图1 桃红四物汤-黄褐斑交集靶点韦恩图

图2 PPI 网络图

图3 Cytoscape PPI 网络图

2.4 构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络

网络图共包括115 个节点，485 条相互作用关系，见图4。图中红色代表疾病，绿色代表中药，蓝色代表药物有效成分，黄色代表共有靶点。根据Degree 值筛选出关键活性成分主要为叶酸、槲皮素、β-胡萝卜素、（+）-儿茶素、木脂素、胆固醇、黄芩苷、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚。

图4 “桃红四物汤-活性成分-靶点-黄褐斑”网络图

2.5 GO 分析与KEGG 富集分析

GO 分析结果显示，53 个交集靶点基因在509 个生物过程（BP）、32 个细胞组成（CC）和47 个分子功能（MF）中显著富集，共588 个条目（P＜0.01）。治疗靶点集中于黑素小体、黑素颗粒、囊泡、转录调节复合物等区域，主要针对信号受体配体结合、转录因子结合、酶结合等过程发挥作用。每个模块分别根据P 值升序排序取前10 位绘制气泡图，见图5。KEGG 通路富集分析共得到68 条信号通路，筛选升序排名前20 条条目绘制气泡图，见图6，提示治疗黄褐斑主要通过黑色素生成、雌激素信号通路、癌症与其糖蛋白、甲状腺激素信号通路、内分泌抵抗、Rap1 信号通路、PI3K-AKT 信号通路等途径。

图5 GO 分析

图6 KEGG 富集分析

2.6 分子对接

将关键活性成分与核心靶基因进行分子对接，结果见表2。结合能＜0 表明配体和受体可以在没有外力的情况下自发结合，一般认为结合能＜-5 kcal/mol 表明配体与受体易于相互作用。本研究发现，活性成分与核心靶蛋白对接结果均小于该值，显示出良好的结合力和稳定性，取对接结果最佳的前三位做可视化处理，结合模式见图7。

图7 部分药物活性成分与靶点对接示意图

表2 分子对接结合能（kcal/mol）

3 讨论

黄褐斑是一种常见的获得性色素沉着性疾病，多由暴露于外部因素、激素水平异常、遗传易感性以及皮肤炎性反应引起[8]。其病理表现为黑素细胞活化、纤维变性、基底膜带改变、血管化增加以及肥大细胞计数增加[9-10]。这提示黄褐斑不仅是一种局限于黑素细胞的疾病，更是一种光老化疾病[11]。桃红四物汤已被发现具有抗炎镇痛、抗氧化、调节免疫、调节血管微循环等作用[7]。目前用于多种皮肤病的临床治疗当中，但其治疗黄褐斑的机制尚未明确。

本研究通过网络药理学挖掘出桃红四物汤活性成分58个，对应桃红四物汤靶基因11 139 个，发掘黄褐斑疾病靶点55 个，两者取交集得到53 个交集靶点。其中桃红四物汤的核心成分为叶酸、槲皮素、β-胡萝卜素、（+）-儿茶素、木脂素、胆固醇、黄芩苷、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚。核心药物活性成分主要可以分为以下几类：①多酚类：槲皮素、（+）-儿茶素、木脂素、黄芩苷、木犀草素、山奈酚；②固醇类：胆固醇、β-谷甾醇；③萜类：β-胡萝卜素；④维生素类：叶酸。多酚具有消除炎性反应、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗菌、免疫调节、降糖降脂等多种作用，可以通过调控PKA/CREB/MITF 通路和ROS 的产生来抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成，还能调节肠道屏障功能，通过肠脑轴对代谢、神经、内分泌和免疫产生影响[12-13]。研究表明，固醇类化合物与抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗菌和免疫调节等多种作用有关，其中β-谷甾醇可以抑制肠道对胆固醇的吸收，胆固醇参与囊泡的合成与释放，能调节细胞信号交流和分泌功能[14-15]。萜类化合物具有广泛的药理活性，如抗病毒、抗癌、抗感染、保肝等[16]。类胡萝卜素是肤色的影响因素之一，作为抗氧化剂抑制ROS起到光保护作用，还具有预防皮肤老化和皮肤癌的作用[17-18]。叶酸又称维生素B9，参与光生物学过程，研究发现其可抑制ALB 的糖基化，减少氧化应激和细胞炎症的发生，调节黑色素的生物合成[19-20]。

本研究通过富集分析与分子对接技术推测，桃红四物汤可能通过调控ALB、VEGFA、CD4、ESR1、CREB1 等靶点，来干预黑色素生成、内分泌抵抗、Rap1 信号通路、PI3K-AKT 信号通路等生物过程，最终实现对黄褐斑的治疗作用。ALB 负责调节人体生理功能，是人体血浆抗氧化能力的主力军，已被广泛用作血管内皮生长因子、干扰素、白介素、抗体分子等的稳定剂[21]。VEGFA 参与许多血管生成依赖性疾病的发生及其进展，有研究报道，通过ATM-SerRS 通路介导可以控制紫外线暴露时VEGFA 的表达，从而达到预防紫外线造成的血管生成相关病理变化的目的，如皮肤老化、皮肤肿瘤形成等[22]。此外，VEGF 还受ROS 水平的影响，ROS 导致的线粒体DNA 损伤会抑制VEGF 的上调，导致血管生成受损[23]。ESR1 参与雌激素分泌、内分泌抵抗、乳腺癌等多个信号通路，驱动内分泌抵抗和肿瘤进展，突变后能促进内质网转录活性[24]。CD4 位于T 细胞表面，与免疫密切相关，已有研究发现光暴露导致的皮肤病变上的炎性浸润主要由CD4+T 细胞、CD68+巨噬细胞和肥大细胞组成，这些细胞通过增强促炎介质的合成，可以进一步激活酪氨酸酶，从而促进黑色素生成[25]。分子对接中CREB1 与药物活性成分对接结果最优，CREB1 是黑色素生成通路中的关键蛋白，通过促进MITF 的表达激活酪氨酸酶，从而导致黑色素生成[26]。

综上所述，本研究利用网络药理学和分子对接技术，分析了桃红四物汤作用于黄褐斑的相关靶点及通路，推断桃红四物汤活性成分叶酸、槲皮素、β-胡萝卜素、（+）-儿茶素、木脂素等可通过调节ALB、VEGFA、CD4、ESR1、CREB1 等相关靶点达到抗凝血、抗黑素、抗感染、抗氧化和抗凋亡的作用，进而实现对黄褐斑的治疗作用。本研究为黄褐斑的中药治疗遣方用药提供了借鉴，为课题组后续实验提供了理论依据。但本研究的结果受数据库更新情况、数据库间信息差异、疾病研究进展等问题的限制，可能存在一定的偏倚，仍需要通过进一步的临床和实验研究加以验证。