聚多巴胺仿生法制备的聚己内酯螺钉羟基磷灰石涂层对兔前交叉韧带重建后骨整合的影响

任铖真,毕方刚,王志远,王亚飞,李鹏举,田 科

1)郑州大学第一附属医院骨科六病区 郑州 450052 2)西安市红会医院关节外科膝关节病区 西安 710000

前交叉韧带位于膝关节内,是膝关节重要的稳定结构,主要作用为限制胫骨向前过度移位和极端旋转[1]。前交叉韧带损伤会影响患者的运动能力,若不及时治疗,还会导致骨关节炎和半月板撕裂。目前,一般采用前交叉韧带重建术治疗前交叉韧带损伤[2],界面螺钉是前交叉韧带重建术中移植物固定的常见形式。早期固定螺钉的主要材质是金属合金,但金属具有生物惰性,很难与骨组织结合,导致种植体逐渐松动[3]。聚己内酯(polycaprolactone,PCL)是一种可吸收的脂质聚酯材料,因其可控性和可降解性而被考虑用作骨再生、骨修复的生物支架,但PCL是一种疏水高分子聚合物,不利于细胞附着[4],因此需要利用表面改性技术以实现牢固的骨整合。羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)是一种具备生物活性的磷酸钙,构成了骨组织的大部分无机成分[5],生物相容性和生物医用性较高,可在体内缓慢降解,引导骨再生,从而获得最佳的机械强度[5-6]。研究[7]发现多巴胺在弱碱性环境下通过相互氧化聚合形成的聚多巴胺几乎可在任何形状和种类的基底材料表面和内部制备出HA涂层。本实验利用聚多巴胺仿生法在3D打印的PCL螺钉表面制备HA涂层,并通过动物实验探究HA涂层对前交叉韧带重建术后骨整合的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器12周成年雄性新西兰大白兔20只,体重(2.6±0.5) kg,购于郑州大学实验动物中心,双下肢活动度良好,无红肿和畸形,前抽屉实验和Lachman实验均为阴性。动物实验方案均符合郑州大学第一附属医院伦理委员会要求,并获审核通过(伦理审核编号:KY-2021-0235)。HA(上海华蓝化学科技有限公司),多巴胺、聚甲基丙烯酸甲酯(美国Sigma-Aldrich公司),戊巴比妥钠(德国MERCK公司),1.5倍模拟体液(青岛捷世康生物科技有限公司);迈普医疗3D打印机(河南省3D打印中心),Micro-CT摄影系统(瑞士SCANCO Medical AG公司),扫描电镜(武汉赛维尔生物科技有限公司),Instron电子万能材料试验机(郑州大学物理学院提供)。

1.2 含HA涂层的PCL螺钉的制备通过3D打印机设计、制作直径3.0 mm、长14.5 mm、多孔PCL螺钉(图1A)。根据文献[5]方法采用聚多巴胺仿生法制备HA涂层。首先将盐酸多巴胺溶解于10 mmol/L Tris-HCl缓冲液中制备2 g/L的多巴胺溶液并将其pH值调整为8.5,烧杯中加入多巴胺溶液以及用乙醇洗净的PCL螺钉,置于37 ℃恒温摇床中孵育24 h,取出螺钉,并用大量去离子水反复冲洗以洗去附着的钙磷离子,得到含有聚多巴胺涂层的螺钉。将含有聚多巴胺涂层的PCL螺钉与1.5倍模拟体液加入烧杯中并置于37 ℃恒温摇床中孵育72 h,取出螺钉并用大量去离子水冲洗,HA涂层制备完成(图1)。扫描电镜下测量含和不含HA涂层的PCL螺钉的孔隙直径及孔隙率。

A:3D打印模型图;B:PCL螺钉大体观;C:扫描电镜下PCL螺钉微观结构;D:含HA涂层的PCL螺钉大孔;E:扫描电镜下含HA涂层的PCL螺钉表面观。

1.3 实验动物分组兔双侧后肢均制备前交叉韧带重建模型,左右侧随机植入含HA涂层的PCL螺钉(实验组)和不含HA涂层的PCL螺钉(对照组)并标记,各20个。

前交叉韧带重建模型的构建:实验动物用30 g/L戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)静脉注射麻醉,双侧后肢常规备皮,用碘和体积分数70%乙醇的混合溶液清洗消毒,于膝关节正中做3 cm纵向皮肤切口,依次切开皮肤筋膜层,于膝关节胫骨内髁找到半腱肌肌腱,沿两端尽可能长地游离切取肌腱,两端用手术缝合线编织固定,置于生理盐水中用于后续移植;髌骨外翻脱位后暴露关节腔,明确前交叉韧带止点后,于两端切断前交叉韧带;分别于股骨、胫骨止点沿前交叉韧带走行方向以3.0 mm钻头钻孔制作股骨、胫骨隧道,将制备好的肌腱移植物穿过骨隧道,助手暂时稳定两端,沿股骨外髁植入经环氧乙烷消毒的界面螺钉用于固定移植物(图2),随后将移植物胫骨端加强固定于骨膜上,充分止血后冲洗关节腔,缝合创面;术后自由活动,肌内注射青霉素10万U/(kg·d),连续5 d。

A:取出半腱肌肌腱;B:植入界面螺钉。

1.4 标本收集术后6、12周分别采用高浓度二氧化碳窒息法处死10只兔,使用手术刀剔除膝关节附近软组织,离断后交叉韧带及内外侧副韧带,用手工锯切下股骨近端、胫骨远端,制备股骨-前交叉韧带-胫骨复合物标本,用于后续观察和检测。

1.5 组织学观察随机抽取5只兔的股骨-前交叉韧带-胫骨复合物标本,于40 g/L多聚甲醛中固定72 h后,经乙醇溶液梯度脱水、聚甲基丙烯酸甲酯包埋后,使用硬组织切片机将骨组织切割成50 μm厚薄片,Masson染色后于光镜下观察螺钉与骨组织界面。

1.6 Micro-CT扫描剩余5只兔的10个股骨-前交叉韧带-胫骨复合物标本放入-80 ℃冰箱保存,测试前放入4 ℃冰箱内过夜融化。采用Micro-CT扫描后使用软件自动分析计算距关节面5 mm、骨道周围2 mm以内股骨骨道的骨长入参数:骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离率、骨密度。

1.7 生物力学测试Micro-CT测试结束后,将股骨与胫骨分别用缝线固定在Instron电子万能材料试验机夹具上,测定预载1 N、拉伸速率15 mm/min条件下韧带断裂时的最大拉力峰值。

1.8 统计学处理应用SPSS 22.0处理数据。采用重复测量数据的方差分析分析涂层和时间对骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离率、骨密度及最大拉力峰值的影响,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两种螺钉的基本参数扫描电镜测得不含HA涂层的PCL螺钉大孔长(470±25) μm、宽(406±29) μm、孔隙率(45±5)%,含HA涂层的PCL螺钉大孔长(375±20) μm、宽(310±27) μm、孔隙率(41±6)%。

2.2 伤口愈合情况和Masson染色结果见图3。植入螺钉后兔切口均愈合良好,未出现红肿、流液等排异反应。术后6周,对照组螺钉与骨组织间有薄层纤维组织及少量新生骨形成,实验组HA 涂层下可见少量皮质骨上有新生骨形成;术后12周,实验组和对照组均可见大量新生骨组织,但实验组新生骨组织浸润深度和量均明显优于对照组。

A1、A2:分别为对照组6周和12周;B1、B2:分别为实验组6周和12周;蓝色为新生骨组织,红色为成熟骨组织。

2.3 Micro-CT观测结果术后6周,两组骨隧道内新生骨较少,新生骨小梁稀疏,术后12周,两组新生骨均较6周时增多,新生骨小梁排列紧密;术后6、12周,实验组均优于对照组。具体指标见表1。与术后6周相比,两组术后12周骨体积分数、骨小梁数量、骨密度均升高,骨小梁分离率降低;实验组以上指标均优于对照组。

表1 两组术后6周和12周Micro-CT观测指标的比较(n=5)

2.4 生物力学测试结果见表2。由表2可知,6周时螺钉与骨界面的愈合强度较小,12周时愈合强度增大,且实验组均高于对照组。

表2 两组最大拉力峰值比较(n=5) N

3 讨论

理想的骨植入材料应能够提供早期负重又能加快骨整合,其中制备HA涂层是促进骨整合的常用方法。目前,HA涂层的制备尚无公认标准。Jalali等[8]利用溶胶-凝胶法在钛种植体表面制备HA和二氧化钛中间层介孔薄膜,生成的HA复合材料涂层为多孔连续结构,具有良好的渗透性,过程易控制,操作方便,但是凝胶干燥过程中易开裂,较高的孔隙率导致涂层与基体的结合强度降低;秦杰等[9]利用微弧氧化技术制备HA涂层,该技术得到的HA涂层与基底材料贴合良好,可在复杂的几何表面及内部形成均匀的涂层,但微弧氧化技术成本高昂,不适合大量制备。聚多巴胺仿生法操作简单、价格低廉,是近年来的研究热点之一。研究[7,10-13]发现该方法几乎可在任何形状、任何材质的基底材料上形成聚多巴胺,且形成的HA涂层与基底材料结合紧密。此外,研究[14-15]发现利用聚多巴胺改性基底,可显著改善细胞的贴附能力,而且有利于固定成骨因子,使得细胞的增殖、分化以及成骨基因表达功能得到改善;聚多巴胺本身还能够作为中间层吸附各种离子、生物大分子及药物等。

影响聚多巴胺涂层形成的因素有很多,如浸泡时间、温度、Tris-HCl缓冲液pH值、多巴胺质量浓度等[16-17]。有研究[9,17]表明制备聚多巴胺涂层的最佳多巴胺质量浓度为2 g/L、Tris-HCl缓冲液pH为8.5,此时制备出的聚多巴胺涂层为规则圆球状、大小均一的聚多巴胺纳米球,因此本实验将PCL螺钉浸泡在2 g/L的多巴胺Tris-HCl溶液中(10 mmol/L,pH 8.5)来制备聚多巴胺涂层,然后将含聚多巴胺涂层的PCL螺钉转移至1.5倍模拟体液中,聚多巴胺中的儿茶酚基团和模拟体液中的金属离子强烈结合,钙离子和磷酸盐离子共沉淀形成HA涂层。研究[9,14]发现该方法制备的HA涂层在强超声作用1 h后仍然保持稳定,HA仍然牢固地附着在基底材料上。本研究将聚多巴胺仿生法制备的含有HA涂层的PCL螺钉用于兔后肢前交叉韧带重建术,术后通过Masson染色、Micro-CT和生物力学测试等手段观测,结果显示术后6、12周,HA涂层具有加快周围骨组织长入、加强骨愈合强度的作用,同时材料植入后切口均愈合良好,未出现红肿、流液等排异反应,说明HA涂层生物相容性好,能够促进前交叉韧带重建术后骨整合,提高界面螺钉生物力学稳定性,HA良好的生物活性可能在PCL螺钉置入后早期的生物力学稳定性中起主导作用。