L-苹果酸的生产方法、生理功能及其应用

盛明俊 詹 凯 马 龙

（蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽蚌埠 233000）

苹果酸，又名2-羟基丁二酸，分子式为C4H6O5，相对分子质量为134.09。苹果酸的分子中存在一个不对称碳原子，有2种异构体，在大自然中以D-苹果酸、DL-苹果酸和L-苹果酸3 种形式存在。D-苹果酸难以被人体吸收利用，经过化学合成法生产出来的DL-苹果酸可能具有一定的毒性，而L-苹果酸可以被人体吸收利用，并且具有一定的生理功能[1]。本文介绍了L-苹果酸的生产方法和生理功能，探究了酶转化或细胞转化法和微生物发酵法的研究进展，综述了L-苹果酸在食品工业中的应用情况，对L-苹果酸在食品工业中的应用前景和生产方法的研究方向进行了展望，为L-苹果酸的进一步研究提供参考。

1 L-苹果酸的生产方法

L-苹果酸的生产方法由直接提取法、化学合成法发展到目前的酶转化或细胞转化法和微生物发酵法等。

1.1 直接提取法

L-苹果酸广泛存在于蔬菜和未成熟的水果中。直接提取法的操作原理是先将未成熟的苹果、葡萄和桃的果汁或蔬菜汁煮沸，后加入石灰水，得到钙盐沉淀；随后将钙盐转变为铅盐，并经处理得到游离酸，即可得到L-苹果酸。此法生产工艺简单，但生产成本高，生产效率低，难以进行批量生产，生产局限性较大[2]。

1.2 化学合成法

化学合成法主要有高温高压水合法、环戊二烯氧化法和糖醛氧化法等[3]。高温高压水合法是化学合成法中生产L-苹果酸的主要方法。该法原理是以丁烯二酸为原料，在高温高压条件下与水发生水合作用得到DL-苹果酸。此法生产出来的DL-苹果酸的衍生物顺丁烯二酸和反丁烯二酸需要除去。环戊二烯氧化法以环戊二烯为原料，与过氧化氢发生氧化反应生成甲酰乙烯酸，进一步反应生成DL-苹果酸。糖醛氧化法以糖醛为原料，与过氧化氢反应，在超声波作用下转化为丁烯二酸和DL-苹果酸。以上这些化学合成法产生的DL-苹果酸都需要进一步分离纯化，才能得到L-苹果酸。此外，化学合成法生产的DL-苹果酸具有一定的毒性，即所产生的DL-苹果酸有近1/2不能用于食品工业，生产成本较高，转化率较低。

1.3 酶转化或细胞转化法

酶转化或细胞转化法以富马酸为底物，在延胡索酸酶的作用下生成苹果酸盐，经过过滤、浓缩、结晶和干燥，最终得到L-苹果酸。酶转化或细胞转化法相对于直接提取法和化学合成法，其生产成本更低，转化率更高。相关学者对该方法进行了大量研究。胡永红等[4]利用生物反应分离耦合原理，以富马酸钙为底物，采用游离延胡索酸酶直接转化生成苹果酸钙，研究发现，在转化温度为40 ℃、pH 为7.0～7.5 的条件下，3.2 kg 的富马酸钙可以在20～28 h内被1 L延胡索酸酶液转化生成苹果酸钙，转化率高达99.9%。这种方法更简单，转化率更高。

影响L-苹果酸转化率的因素有副产物浓度、温度和pH 值。目前可以通过在转化反应中添加抑制剂来抑制副产物的生成。同时，酶转化或细胞转化法也可以通过加入高效转化菌株和活性剂来提高酶活力，从而在一定程度上降低生产成本，并提高L-苹果酸的生物转化率。Hronska 等[5]将诺卡氏菌属的菌株应用于富马酸到L-苹果酸的生物转化过程中，结果表明，温度37 ℃、pH值8.0是诺卡氏菌属菌株转化富马酸为L-苹果酸的最佳转化条件。此外，在发酵培养基中加入诱导剂（富马酸盐）还可以提高富马酸酶的活性，提高L-苹果酸的生物转化率。刘亚等[6]以米根霉突变株CICC40503-JST 为菌种，葡萄糖为碳源，对其发酵工艺及葡萄糖代谢途径进行了研究，发现葡萄糖100 g/L、（NH4）2SO44.0 g/L、MgSO40.3 g/L、FeSO4·7H2O0.025 g/L、KH2PO40.5 g/L、ZnSO40.1 g/L 和CaCO380 g/L 是最佳培养基配方。使用Sartorius 发酵罐，在发酵温度32 ℃、通气量0.20 L/（min·L）、转速500 r/min、孢子悬浮液单独培养48 h 后进行补料发酵以及发酵周期72 h 的试验条件下，L-苹果酸的产量为57.71 g/L，结果表明，米根霉在葡萄糖发酵中的应用可以显著提高L-苹果酸的产量。

1.4 微生物发酵法

利用微生物发酵法生产L-苹果酸是当前研究的热点。根据发酵方式和步骤，微生物发酵法可分为一步发酵法和两步发酵法。一步发酵法采用单一菌种进行发酵培养，将碳源转化为L-苹果酸。两步发酵法使用2 种不同的微生物，分别将碳源转化为富马酸，然后将富马酸转化为L-苹果酸[7]。利用微生物发酵法提高L-苹果酸产量有以下方式：一是利用外部环境胁迫来积累L-苹果酸，这是微生物积累有机酸的常见方式[8]；二是通过增加L-苹果酸的合成代谢途径来积累L-苹果酸；三是提高对代谢产物的搬运能力，从而提高L-苹果酸的产量。

基于以上策略，学者们对L-苹果酸进行了大量研究。洪鹏辉[9]以一株能利用木糖的大肠杆菌重组菌，重新构建了一条由木糖合成苹果酸的代谢途径，并研究了敲除与L-苹果酸代谢相关的基因maeA、maeB、mdh和fumABC对L-苹果酸合成的影响。结果表明，在敲除maeA、maeB、mdh和fumABC等与L-苹果酸代谢相关的基因后，L-苹果酸的产量不断提高，但是在菌株发酵过程中会产生副产物，抑制了L-苹果酸的生成。在以多拷贝质粒pEn为载体的基础上，过表达glcB和glcDEF的MA-10菌株培养72 h，能消耗木糖5.22 g/L，并产生苹果酸4.53 g/L，产率达到理论产率的97%。

利用基因工程菌发酵生产L-苹果酸是一个重要的研究方向。Kang等[10]利用工程酿酒酵母生产L-苹果酸，结果表明，与较高木糖浓度（20、40 g/L）相比，工程酿酒酵母菌株可从较低浓度（10 g/L）的木糖中获得更高的苹果酸产量，并且不产生乙醇。这证实了改造过的酿酒酵母可以高效生产L-苹果酸，为苹果酸的生产提供了新的思路，证明了利用基因工程菌发酵生产L-苹果酸的可行性。

Kövilein 等[11-12]发现米曲霉即使在高运作状态下仍能产生有机酸，这表明乙酸盐可作为微生物生产有机酸的碳源，并可作为进一步优化L-苹果酸生产工艺的基础。其研究发现，在温度为32 ℃时，苹果酸的产量最高。与确定的氮源（NH4）2SO4相比，使用复合氮源酵母提取物培养可以加速苹果酸的合成。在重复分批过程中，总酸产量在发酵前240 h内最高。然而，该试验工艺还有待进一步改进，以在后续的循环中保持L-苹果酸的高生产率。Schmitt等[13]采用重复批次培养法提高米曲霉DSM 1863 产L-苹果酸的能力，研究表明只要碳源、氮源和碳酸钙补充及时，L-苹果酸的生产率可以显著提高，该研究为L-苹果酸的生产提供了重要参考。

Robazza 等[14]发现将热解水冷凝液和热解合成气与厌氧微生物共同发酵，在二次发酵阶段可实现L-苹果酸的生产，其研究表明混合培养物可以同时进行合成气发酵和PAC解毒。PAC解毒将通过合成气和PAC发酵产生的乙酸进一步稳定为L-苹果酸。此工艺除了能生产出所需的L-苹果酸外，还可以同时对热解产生的气态和含水废物进行解毒和回收，具有较高的经济价值。

在微生物发酵中，富马酸优于其他原料，工业生产L-苹果酸多以富马酸法为主[8]。为降低化石燃料的消耗以及减少环境污染，化学合成法和酶转化法生产L-苹果酸逐渐被微生物发酵法所替代。实践中，微生物发酵法仍然存在一些待改进之处，例如，发酵副产物中可能出现延胡索酸等杂酸[15]。此外，微生物发酵法生产苹果酸的菌种较少，选择有限，野生型菌株在生产L-苹果酸的同时会产生大量的副产物。因此，菌株的选育十分重要。通过分子生物学方法构建L-苹果酸工程菌株，可以有效降低副产物的影响，更高效地将目标产物转化为L-苹果酸。

2 L-苹果酸的生理功能

L-苹果酸是一种天然有机酸，也是TCA 循环的重要中间产物，在生物体内发挥着代谢枢纽的作用。L-苹果酸是人体代谢过程中产生的重要有机酸，是三羧酸循环的中间代谢产物，能够迅速通过细胞膜进入线粒体内，直接参与线粒体能量代谢。同时，L-苹果酸又是苹果酸-天冬氨酸穿梭的组成部分，对胞液和线粒体之间还原当量的转移起着重要的作用，具有抗氧化、改善记忆和提高运动能力等生理功能。

2.1 抗氧化

L-苹果酸可以促进细胞体内ATP 的生成，捕获自由基，具有抗氧化的生理功能。曾晓琮等[16]采用含有SYBR Green I的实时逆转录聚合酶链反应法研究了L-苹果酸增强线粒体抗氧化作用的分子生物学机制。试验对12 月龄的SD 大鼠灌胃L-苹果酸30 d 后，发现苹果酸组中大鼠心肌细胞AGC、OMC、CAT 和GSH-Px 的mRNA 表达量分别是空白对照组的1.25、1.39、1.12和1.01倍，苹果酸组中大鼠肝脏细胞AGC、OMC、CAT 和GSH-Px 的mRNA 表达量分别是空白对照组的1.33、1.02、1.25 和0.94 倍。L-苹果酸通过促进苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白以及抗氧化酶的基因表达，提高线粒体的抗氧化作用。吴军林等[17]以24月龄的大鼠作为老年动物模型，给大鼠灌胃L-苹果酸30 d后，评价L-苹果酸对老年大鼠不同组织中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性的影响。与老年对照组相比，老年苹果酸组大鼠的肝脏TSOD、CuZnSOD及GPx活力提高至接近年轻大鼠的水平。结果表明，补充L-苹果酸可以提高肝脏中TSOD、CuZnSOD和GPx的活力。根据相关理化指标变化可知，L-苹果酸是通过增强各种抗氧化酶活性来提高机体的抗氧化能力，从而减轻肝组织中的过氧化损伤。

2.2 改善记忆

邓龙祥等[18]将16 只大鼠随机分为对照组（SD+生理盐水）和实验组（SD+L-苹果酸），使用多平台水环境法建立大鼠SD模型，在SD 48 h和SD 72 h后进行Morris 水迷宫测试，以评估大鼠的记忆能力。结果显示，实验组大鼠在SD 48 h和SD 72 h的水迷宫反应时间均明显小于对照组，这表明L-苹果酸能够改善睡眠剥夺对大鼠学习记忆能力的影响。

王立琴等[19]选取了90只16月龄的雄性小鼠，按随机数字表法将其随机分为6组，包括空白组、铝染毒组、维生素C 组、0.05 g/kg L-苹果酸组、0.15 g/kg L-苹果酸组和0.45 g/kg L-苹果酸组，每组15 只。对后5组小鼠采用大脑侧脑室注入AlCl3法来复制铝染毒模型。染毒结束后，分别对L-苹果酸0.05、0.15和0.45 g/kg 组的小鼠进行0.05、0.15 和0.45 g/kg L-苹果酸灌胃，每天1 次，连续进行90 d。结果表明，L-苹果酸可以明显改善铝暴露导致的学习记忆损害情况。这种改善的机制可能与L-苹果酸的抗氧化损伤，提高NADPH 表达水平，继而降低Aβ1～42的表达水平有关。

2.3 提高运动能力

L-苹果酸是一种天然的有机酸，具有延缓疲劳和提高机体糖原储备的功能[20]。有机酸对于体育运动功能有着积极意义，尤其是耐力性运动和需要减控体重的运动项目。服用苹果酸可以缓解运动后的肌肉疲劳，并帮助无氧运动后心率的恢复，同时提高人体的无氧做功能力。苹果酸通过三羧酸循环途径和苹果酸-天冬氨酸穿梭来提高运动能力，还可以通过影响线粒体机制和保护心血管系统来提高运动能力[21]。

3 L-苹果酸在食品工业中的应用

L-苹果酸是一种有机酸，主要用于食品工业。L-苹果酸的酸味柔和别致，可与柠檬酸复配使用，也可替代柠檬酸使用。在软饮料生产中，通常增加L-苹果酸的用量，减少柠檬酸的用量。L-苹果酸的酸度比柠檬酸大，具有特殊的香味，有助于氨基酸的吸收，是新一代的食品酸味剂[2]。L-苹果酸的允许摄入量（ADI）不作特殊规定，现已成为继柠檬酸、乳酸之后的第三大有机酸食品酸味剂。

3.1 pH调节方面

L-苹果酸是一种天然有机酸，易溶于水和乙醇，是良好的食品酸味剂，广泛应用于食品工业中。L-苹果酸可以增加食品的酸度和酸味，作为食品酸味剂、食品酸化剂和食品增酸剂应用于碳酸饮料、酸奶、糖果和葡萄酒等食品中。与目前使用量较大的柠檬酸相比，L-苹果酸最大限度地保留了天然果实的酸味，口感优于柠檬酸。王娟等[22]以茯苓和大米为主要原料，通过单因素和正交试验，研究了茯苓汁和米酒汁配比、L-苹果酸添加量和蜂蜜添加量等因素对茯苓米酒感官品质的影响。结果表明，茯苓米酒的最佳配方为茯苓汁∶米酒汁=1∶3，L-苹果酸添加量0.1%，蜂蜜添加量3%，在此配方下制作的米酒酒精度为4.5% vol，感官评分高，并且各项基本理化指标均符合标准。按此配方制作的茯苓米酒风味协调，口感柔和，酸甜适中。

3.2 酯化淀粉方面

王子良[23]以玉米淀粉和苹果酸为原料，采用干法制备苹果酸玉米淀粉酯（MCS），研究了各个因素对取代度的影响，在苹果酸与淀粉的质量比为0.58、反应温度146.9 ℃、反应时间5.5 h、pH 值1.41 的试验条件下，制得的苹果酸淀粉酯的取代度为0.331。结果表明，各个因素对苹果酸玉米淀粉酯的影响顺序依次为反应温度＞苹果酸与淀粉的质量比＞pH值＞反应时间。Shi 等[24]研究了苹果酸淀粉的取代度（DS）、颗粒形态、晶体结构、糊化特性和消化性。结果表明，随着处理时间的增加，苹果酸淀粉的取代度（DS）呈增加趋势，苹果酸淀粉的这些特性使其可以用于淀粉改性，以生产抗性淀粉，并为淀粉提供了新的应用。Na 等[25]以玉米、马铃薯和甘薯为原料，经L-苹果酸酯化得到抗性淀粉（RS），其结构特征和取代度（DS）对结晶性能有着独特影响。结果表明，随着DS含量的增加，RS含量也增加。与对照组相比，经过苹果酸处理后的组别，淀粉RS 的含量有所增加。在温度130 ℃、反应时间12 h 的条件下制备的苹果酸淀粉酯表现出较高的热稳定性。

3.3 药食两用方面

黑豆是一种药食两用作物，易于消化，含有丰富的维生素和微量元素。丁洁等[26]以黑豆皮为原料，以花色苷含量为指标，在单因素试验基础上，采用正交试验设计法优化了L-苹果酸提取黑豆皮花色苷的工艺。结果显示，在提取温度为30 ℃，提取时间为60 min，苹果酸质量分数为30%，料液比为1∶30（g∶mL）时，该工艺达到最佳效果，此时提取的花色苷含量为3.538 mg/g。试验为使用L-苹果酸辅助提取药食两用作物提供了依据，也为药食两用功能性食品的生产提供了参考。

3.4 水产品方面

鱼类是常见的水产品之一，包括淡水鱼和部分海水鱼，其鱼肉可供食用。与其他肉类相比，鱼类肉质细嫩鲜美，富含维生素和矿物质，是人体良好的营养来源。Chen 等[27]在吉富罗非幼鱼的饲料中添加不同水平的L-苹果酸，观察L-苹果酸浓度对幼鱼生长、饲料利用和消化功能的影响。结果表明，在幼鱼的饲料中添加0.5 g/kg L-苹果酸不仅促进了幼鱼的生长，还提高了饲料的利用率。敬婷等[28]选取均重为（16.25±0.03）g 的湘云鲫450 尾，随机分为6 组（每组3 个重复，每个重复25 尾），在原来的湘云鲫饲料中分别添加0、1、2、4、8和16 g/kg的L-苹果酸，试验期为90 d。结果表明，L-苹果酸在湘云鲫饲料中的适宜添加量为4～8 g/kg，该添加量可促进湘云鲫生长。李赞[29]通过在罗非鱼的基础日粮中添加不同水平的L-苹果酸，研究了L-苹果酸对罗非鱼胃肠道结构、功能及肝脏TCA循环的影响。结果表明，在吉富罗非鱼饲料中添加适量（1.0～8.0 g/kg）L-苹果酸，能够改善罗非鱼胃、前肠和中肠的形态结构，提高胃肠的消化和吸收能力，并提高肝脏TCA循环的效率。

3.5 畜产品方面

畜产品指家禽和家畜等农产品，主要为肉类。牛肉和鸡肉等是日常生活中常见的畜产品，富含碳水化合物、矿物质和微量元素等多种营养物质，是人体摄入能量的较好来源。冯剑美[30]通过试验得出，在肉牛的日粮中添加苹果酸的最佳浓度为8%。这不仅可以提高肉牛的生产性能，还可以最大限度地降低肉牛瘤胃中甲烷的排放量，从而对牛舍内的空气质量起到明显改善作用。李笑等[31]选取300只1日龄的青脚麻鸡母鸡，随机分为5 组，每组5 个重复，每个重复12 只鸡，研究苹果酸对青脚麻鸡生长性能、屠宰性能、肉品质、肌肉生化指标及抗氧化功能的影响。结果表明，饲料中添加0.2%苹果酸能够提高青脚麻鸡胸肌CAT活性，添加0.4%苹果酸能够提高胸肌糖原含量和CAT活性，添加0.8%苹果酸能够提高胸肌CAT活性，添加1.6%苹果酸能够降低胸肌MDA 含量。综合各项指标，推荐在青脚麻鸡饲料中添加0.4%苹果酸，可以提高青脚麻鸡肉的抗氧化能力，阻止鸡肉进一步氧化，维持细胞完整，改善鸡肉品质。鲍文梅等[32]选取288只1日龄的爱拔益加（AA）肉鸡，随机分成4组，每组6个重复，每个重复12只鸡（公母各占1/2）。对照组饲喂基础饲料，3 个试验组分别饲喂额外添加0.40%（T1组）、0.80%（T2组）和1.20%（T3组）L-苹果酸的饲料，试验周期42 d。以生长性能和肉品质指标为判断依据，L-苹果酸在肉鸡饲料中的适宜添加量为0.47%～0.59%。结果表明，添加L-苹果酸能够提高肉鸡血清T-AOC、T-SOD、GSH-Px和CAT活性，降低血清MDA含量，提高肉鸡自身的抗氧化能力。

4 结语

L-苹果酸的生产方式已经从直接提取法发展到化学合成法、酶转化法和微生物发酵法等。相较于其他生产方法，微生物发酵法具有生产成本低和转化率高等优点，实践中该方法仍需解决副产物繁杂和优良菌株来源不足的问题。相关研究围绕优良菌株的选育、L-苹果酸生产效率的提高、优化工艺中副产物对产品本身乃至环境的影响以及减少副产物和原料浪费等热点展开。L-苹果酸的抗氧化、改善记忆和提高运动能力等生理功能的研究也取得了一定进展，但其中关于改善记忆和提高运动能力等方面的部分生理特性的研究仍需要进一步研究。

目前，L-苹果酸已广泛应用于pH 调节剂、淀粉酯化、药食两用食品、水产品和畜产品等食品工业中。作为新一代食品酸味剂，L-苹果酸在食品领域的应用前景广阔。本文介绍了L-苹果酸的生产方法和生理功能，探究了酶转化或细胞转化法和微生物发酵法的研究进展，综述了L-苹果酸在食品工业中的应用情况，对L-苹果酸在食品工业中的应用前景和生产方法的研究方向进行了展望，为L-苹果酸的进一步研究提供参考。