细胞死亡在脓毒症引起的肾损伤中的作用

周文琛,何朝勇

(中国药科大学,江苏 南京 211198)

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征,是一种以严重的全身炎症和多器官功能障碍为特征的复杂疾病。脓毒症是急性肾损伤(AKI)最常见的病因,占病例的40%以上[1],AKI的主要特征是血清肌酐升高或尿量减少,代表肾脏功能丧失。脓毒症引起的系统性炎症起始于固有免疫系统对病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)如革兰阴性菌外膜的主要结构成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的识别。之后通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)等信号通路触发炎症反应,释放多种炎症介质,导致细胞损伤或死亡,进一步释放损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),引发持续的炎症反应。除了全身炎症外,DAMPs和PAMPs还能与肾脏近端小管中的受体相互作用,导致局部炎症反应,进而导致白细胞浸润和肾小管损伤,并伴有肾脏细胞死亡[2]。肾脏中多种细胞的损伤和死亡被认为是AKI的促发因素[3],而细胞的内质网应激、炎症反应和线粒体损伤等进一步促进AKI向CKD 转变[4]。脓毒症引起肾损伤的机制极其复杂,且至今仍没有标准化和令人满意的治疗策略。

1 脓毒症中的肾脏细胞死亡

肾小管和肾小球是肾脏的主要组成部分,主要由肾血管内皮细胞、肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞和肾间质成纤维细胞组成[5]。这些细胞在肾脏的功能维持中起着重要作用,同时其功能障碍或死亡与脓毒症引起的肾损伤密切相关。

肾血管分布复杂,包括肾动脉、肾小球小动脉、肾小球毛细血管网、弓状动脉和肾毛细血管。肾血管内皮细胞覆盖在肾血管内部,通过对水、关键营养素和电解质的重新吸收,维持全身渗透性、酸碱平衡和细胞外液量的稳态。血浆中存在的内毒素、DAMPs、炎性因子和活性氧(reactive oxygen,ROS)等可导致血管内皮细胞功能障碍和死亡,内皮受损,受损的内皮屏障导致血管通透性增加、促凝血途径激活和多种促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的释放[6],大量液体、内毒素和炎性因子渗入肾间质,损伤肾间质细胞,加重肾脏损伤。同时,浸润的炎性细胞和炎症因子攻击肾小管上皮细胞,肾小管的损伤阻碍肾小管内液体流动,使肾单位失去过滤功能。另外,肾小管上皮细胞既是炎症因子的主要靶点也是重要来源,损伤的肾小管上皮细胞释放一系列炎症因子和生长因子,导致巨噬细胞浸润,系膜细胞增殖,以及肾间质成纤维细胞增殖和表型转化,促进肾小球硬化[4]和肾间质纤维化[7]。而作为先天免疫核心的巨噬细胞同样在肾损伤中发挥重要作用,受损组织释放的PAMPs或DAMPs激活并促进巨噬细胞向促炎表型(M1)转化,促进炎性因子,趋化因子和 ROS的释放[8],进一步影响上文提到的多种肾脏固有细胞。

综上所述,肾脏中血管内皮细胞、肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、肾间质成纤维细胞和巨噬细胞的损伤和功能障碍及其相互联系是脓毒症引起的AKI发生的病理生理基础,也与AKI转化为CKD后肾结构与功能的进一步恶化密切相关。

2 脓毒症中的肾脏细胞死亡类型

脓毒症引起的肾损伤涉及多种细胞死亡途径,这些途径的分子机制不同但相互关联(见图1),细胞死亡形式大致可分为凋亡、坏死、焦亡和自噬等,不同死亡形式对于肾损伤的影响也有所不同。

图1 脓毒症中的肾脏细胞死亡途径

2.1 细胞凋亡细胞凋亡途径是脓毒症诱导的肾损伤的重要分子机制之一。根据起始caspase的不同,哺乳细胞的凋亡可分为3种基本的途径,一种称为外在途径,由细胞表面的死亡受体如Fas 和肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)引发;一种称为内在途径或线粒体途径,由细胞受到刺激后线粒体中凋亡相关因子如细胞色素C的释放引发;另一种是内质网应激所诱导的CHOP引发的凋亡。

在死于感染性休克患者的肾脏活检样本的组织学检查中,TUNEL染色显示在所有脓毒症样本的近端和远端小管中都发现了凋亡细胞[5]。在CLP和LPS诱导的脓毒症动物模型中,在肾小管细胞和血管内皮细胞中观察到了凋亡[9-10]。而在LPS处理的肾小管上皮细胞HK-2细胞中,肾小管细胞损伤标记物KIM-1和NGAL,caspase-3活性,TUNEL阳性细胞均有所增加,同时与凋亡相关的p53、Bax、C-PARP蛋白表达增加[11]。研究表明,LPS刺激会导致TNF-α和Fas配体的水平上升,它们激活TNFR进而激活下游的caspase-3[12],活化的caspase-3移位进入细胞核,导致底物裂解、DNA降解和蛋白质修饰,凋亡小体出现。同时,肾脏是最耗能的器官之一,富含线粒体,内毒素刺激也导致线粒体功能障碍和ROS产生,过量ROS会刺激p53和Bax而诱导凋亡,同时Bax可以促进线粒体跨膜电位的损失和细胞色素C向胞质的释放[13],触发凋亡的内源性途径[14]。因此,凋亡信号通路与脓毒症引起的肾损伤密切相关。

2.2 细胞焦亡相比细胞凋亡,细胞焦亡会导致大量DAMPs和促炎因子的释放以及炎症细胞的活化,从而加剧炎症反应和各种组织的损伤。PAMPs 如LPS刺激会导致中枢炎症反应和炎症小体激活,包括NOD样受体蛋白3 (NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、caspase-1和凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC),进而促进促炎细胞因子IL-1β和IL-18等的成熟。激活的caspase-1切割GSDMD,GSDMD的N端序列结合到膜上并产生膜孔,导致细胞肿胀、膜破裂和细胞死亡。另外,LPS也可直接激活人caspase-4,5或小鼠caspase-11,进而裂解GSDMD,而不依赖于NLPR3和caspase-1的激活,且caspase-11激活诱导的细胞焦亡对小鼠的脓毒症休克至关重要[15]。

巨噬细胞和肾小管上皮细胞中的细胞焦亡在脓毒症相关AKI的发病机制中起重要作用。研究表明,M1型巨噬细胞释放的大量炎症介质是脓毒症时器官损害的重要原因之一[16],而通过抑制M1型巨噬细胞的TNF-α/HMGB1信号通路可抑制LPS诱导的焦亡并改善肾功能[17]。条件性敲除小鼠单核/巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞caspase-11后,GSDMD、IL-1β和IL-18的激活均有所减弱[18]。在野生型小鼠肾小管上皮细胞中,LPS处理后出现显著的细胞焦亡,伴随着caspase-11蛋白表达增加,而来源于caspase-11敲除小鼠的肾小管上皮细胞中焦亡细胞显著减少。同时,LPS诱导的野生型小鼠肾脏损伤严重,其特征为肾小管变性和扩张,失去刷状缘。而caspase-11敲除小鼠中观察到的LPS诱导的肾损伤程度显著降低[19]。Caspase-1抑制剂的使用也减少了NLRP1炎症小体的表达和肾小管上皮细胞的焦亡,并改善CLP诱导的小鼠AKI[20]。另外,研究表明Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil containing protein kinases 1,ROCK1)可能通过TLR2介导的内质网应激/细胞焦亡轴调节脓毒症诱导的AKI[21]。ROCK1在CLP诱导的小鼠肾脏和LPS处理的HK-2细胞中表达显著上升,而敲低ROCK1显著降低LPS诱导的HK-2细胞焦亡。这些结果表明肾脏细胞焦亡可能是脓毒症引起肾损伤的主要机制之一。

2.3 细胞坏死细胞坏死是严重的病理性因素诱发的病理性细胞死亡。受体相互作用蛋白激酶1 (receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)通过激酶依赖性和非依赖性功能调节细胞死亡和炎症,可作用于RIPK3和混合谱系激酶结构域样蛋白 (mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)[22],MLKL是细胞坏死的下游效应器,RIPK3介导其磷酸化[23],p-MLKL形成寡聚体并转运至细胞质膜,导致细胞膜通透性增加,细胞肿胀,最终细胞裂解并释放出内含物,引起炎症反应[24]。

在LPS诱导的脓毒血症小鼠模型中,RIPK1突变提高了小鼠的存活率,且RIPK1突变小鼠的原代巨噬细胞受到LPS刺激后的坏死减少[25]。在CLP小鼠模型中肾脏p-RIPK3和p-MLKL水平显著升高,而RIPK3敲除减缓了肾小管的损伤,同时在HK-2细胞中,使用RIPK3抑制剂进行前处理或敲除RIPK3均改善了LPS诱导的线粒体功能障碍[26]。另外,在肾缺血/再灌注小鼠模型中,使用RIPK1抑制剂Nec-1减少肾小管细胞坏死并改善了肾损伤[27]。另外,RIPK3介导的坏死和GSDMD介导的焦亡在脓毒症中,协同促进巨噬细胞和内皮细胞中的炎症和组织因子释放,从而导致组织损伤[28]。

2.4 细胞自噬与其他形式的细胞死亡不同,细胞自噬可能改善脓毒症引起的肾损伤。在饥饿、缺氧、压力等应激条件下,细胞通过PI3K、PTEN、Akt和mTOR等关键分子调控自噬[29],p53也可通过负调控mTOR促进自噬。细胞内的病原体、受损的蛋白质和功能失调的细胞器被包裹在自噬体中,并在溶酶体中被清除,因此自噬被认为是维持细胞内稳态和应激反应的必要因素[30]。自噬的过程主要包括自噬体的形成、溶酶体与自噬体融合形成自噬溶酶体以及自噬溶酶体中底物的降解。

研究表明,与自噬密切相关的SIRT6和LC3B-II/LC3B-I的表达水平在LPS处理后的小鼠肾脏中显著增加,表明在脓毒症引起的肾损伤中细胞自噬的存在。而在HK-2细胞中过表达SIRT6降低了LPS诱导的TNF-α和IL-6的表达,并减少了细胞凋亡[31]。另外,α2-肾上腺素受体激动剂右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)可通过α2-AMPK-mTOR信号通路增强自噬,抑制NLRP3炎症小体的激活以及IL-1β和IL-18的表达,进而缓解LPS诱导的AKI,而自噬抑制剂3-MA减弱了DEX的作用[32]。在CLP大鼠模型DEX中同样抑制了炎症因子的上调,改善肾损伤[33]。另外,受损的线粒体可以通过被称为线粒体自噬的选择性自噬作用降解,通过被吞噬到自噬体中进行降解来促进受损线粒体的更新。由PINK1-Parkin途径介导的线粒体自噬可清除线粒体ROS并阻止随后的NLRP3炎症小体的活化,进而减少肾小管上皮细胞死亡和组织损伤[34]。这些研究表明,自噬可以通过抑制细胞凋亡和焦亡来减缓脓毒症引起的肾损伤。

3 脓毒症中的肾脏细胞死亡机制

在脓毒症引起的肾损伤中,内质网应激、线粒体动力学失衡、氧化应激和线粒体功能障碍都参与对细胞死亡的调节。深入理解脓毒症引起的肾损伤中细胞死亡机制可以促进有效治疗和预防方法的发展。

3.1 内质网应激在一些异常损伤因素的影响下,内质网不能正常转运蛋白质,导致未折叠蛋白的积累和内质网应激,引发未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction,UPR)以维持细胞稳态。肌醇需求酶1、PKR样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)和激活转录因子6 (activate transcription factor 6,ATF6)3种跨膜蛋白在内质网应激时被激活并激活下游的ATF4、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulating protein 78,GRP78)等,加速UPR[35]。但过度的内质网应激会导致CHOP介导的细胞凋亡[36]等。在脓毒症诱导的AKI过程中,内质网应激同样起着重要作用[37]。

在LPS处理的HK-2细胞中,内质网应激的重要标记物ATF4,CHOP和p-eIF2α水平显著上调,使用黄酮类药物松属素(pinocembrin,PINO)显著改善了LPS引起的内质网应激并减少了细胞凋亡和炎症因子的产生,而在内质网应激激动剂衣霉素的作用下,PINO的保护作用被减弱[38]。在CLP小鼠模型中,含甲烷的盐水溶液可通过抑制内质网应激相关的GRP78/ATF4/CHOP/caspase-12凋亡信号通路,发挥其抗炎、抗氧化和抗凋亡作用,改善脓毒症诱导的AKI[35]。而在肾小管上皮细胞中敲低GRP78抑制了CHOP和caspase-12的激活,减少了LPS诱导的细胞凋亡[39]。另外,使用牛磺酸脱氧酸盐抑制内质网应激,降低了对乙酰氨基酚诱导的肝细胞IL-1β的分泌和活性caspase-1的产生,减少了细胞死亡,表明细胞焦亡也与内质网应激显著相关[40]。另有研究表明,ROCK1在调节细胞焦亡、炎症和内质网应激中起着至关重要的作用[41],在HK-2细胞中,ROCK1敲除可抑制LPS诱导的TLR2、CHOP和GRP78蛋白水平,同时HK-2细胞焦亡率下降,使用TLR2激动剂PAM3CSK4则减弱了这种抑制作用。在CLP小鼠模型中ROCK1敲除同样了减轻了小鼠肾组织细胞的内质网应激和细胞焦亡,同时改善了肾功能,提高小鼠的存活率[21]。这些结果表明ROCK1通过TLR2介导的内质网应激调节细胞焦亡进而改善了脓毒症诱导的肾损伤。

3.2 线粒体动力学失衡线粒体是一类高度动态的细胞器。在生理条件下,线粒体的分裂和融合是一个持续进行的过程,在线粒体质量控制和细胞能量代谢中起着关键作用,融合通过将部分受损的线粒体内容物作为一种补充形式进行混合来帮助缓解压力;分裂产生新的线粒体,同时将线粒体受损的部分与正常部分分开[42]。在哺乳动物细胞中,线粒体融合涉及线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2和OPA1,分裂则依赖于动力蛋白相关蛋白1 (dynamin-related protein 1,Drp1)、线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1,Fis1)等。在应激条件下,细胞可能出现线粒体动力学失衡,在脓毒症引起的AKI中表现为线粒体分裂增加而融合减少,进而造成一系列负面影响。

在CLP诱导的AKI小鼠模型中,肾脏线粒体生物合成和融合受到抑制,而裂变增加,其特征是过氧化物酶体增殖激活受体辅激活因子-1α(peroxisome proliferation-activating receptor coactivator-1α,PGC-1α)和OPA1水平降低,Drp1水平升高,同时晚期CLP小鼠肾脏中的线粒体自噬功能受损,表现为COX IV和LC3的共定位减少,进一步导致了受损线粒体的积累、氧化应激和细胞死亡[43]。在肾脏缺血/再灌注和顺铂诱导的肾毒性实验模型中,DRP1在肾小管细胞损伤早期易位至线粒体,随后发生线粒体断裂、Bax/Bak激活、细胞色素C释放以及caspase酶的激活,进而引起细胞凋亡,使用Drp1药物抑制剂mdivi-1减少了肾小管细胞的凋亡,改善小鼠的肾损伤[44]。而在LPS诱导的脓毒症小鼠模型中,mdivi-1下调了NLRP3炎症小体相关蛋白表达,改善线粒体功能并减轻了肾小管上皮细胞的焦亡[45]。

3.3 氧化应激和线粒体功能障碍普遍认为,急性和慢性肾脏疾病的发展可能均主要归因于控制氧化应激的分子机制失衡[46],而超氧阴离子介导的肾小管损伤可能是AKI进展的重要因素[47]。正常情况下,通过糖酵解和脂肪酸的β-氧化进行的葡萄糖代谢是肾脏的主要能量来源,近端小管细胞主要将脂肪酸作为量来源,产生ATP的主要机制是有氧呼吸[48]。而在脓毒症和缺氧状态下,近端小管细胞通过将丙酮酸转化为乳酸这种效率更低的机制产生ATP,同时三羧酸循环被阻断,这种代谢变化是由AKT/mTORC1/HIF-1α信号通路介导的[49]。糖酵解的增加会产生大量丙酮酸,丙酮酸在线粒体内积聚并形成琥珀酸,而当组织重新供氧时,琥珀酸被迅速氧化,大量超氧阴离子产生[3]。在正常条件下,超氧阴离子可被超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)转化为H2O2,随后被过氧化氢酶(catalase,CAT)分解为H2O,但在脓毒症状态下,肾组织SOD和CAT水平显著降低,ROS水平显著增加,这通常是由酶诱导的ROS产生和抗氧化剂消耗的结果[50]。过量的ROS导致氧化应激并进一步引起线粒体功能障碍,影响细胞的凋亡和焦亡等。ROS可激活p53,抑制BCL-2,进一步激活BAX复合物并在线粒体形成膜孔而诱导凋亡[51]。同时ROS、受损的线粒体膜脂和氧化形式的mtDNA均是NLRP3的活化配体,会诱导NLRP3的激活进而促进细胞凋亡和焦亡[34]。

在许多与肾脏中ROS生成有关的酶系统中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)似乎是最重要的贡献者,通过消耗NADPH产生超氧阴离子和ROS[52]。在小鼠肺内皮细胞中,脓毒症导致NOX1、NOX2和NOX4显著上调,使用siRNA干扰NOX1和NOX4能显著减少ROS的产生,且NOX4干扰降低了CLP诱导的脓毒症小鼠的死亡率[53]。而在LPS或顺铂刺激的肾小管上皮细胞中,NOX的亚单位p47phox、p22phox和NOX4表达上调,且p47phox的膜转位和ROS的产生明显增加[11]。另外,在CLP诱导的AKI模型中,RIPK3在肾小管上皮细胞中表达增加且促进肾小管损伤。同时,RIPK3增强了NOX4的表达并促进NOX4向线粒体转运,进而促进氧化应激和线粒体功能障碍,而RIPK3和NOX4敲除均显著改善了小鼠肾小管损伤[26]。这些结果均表明了氧化应激和线粒体功能障碍在脓毒症诱导的肾损伤中的重要作用。

4 总结与展望

脓毒症引起的肾损伤是一个非常复杂的过程,涉及肾血管内皮细胞、肾小管上皮细胞和巨噬细胞等多种细胞的参与。其中,肾血管内皮细胞功能障碍和死亡导致内皮受损,肾微循环障碍,炎性因子渗入肾间质;肾小管上皮细胞死亡导致肾小管的结构和功能异常;巨噬细胞的焦亡和坏死可全身或局部放大炎症反应,这些都是脓毒症引起的肾损伤的病理生理基础。而内质网应激、线粒体动力学失衡和氧化应激等被认为是细胞死亡的主要诱因。相信通过针对肾脏细胞死亡探索有效的治疗靶点并开发有效的治疗药物,有望改善脓毒症引起的肾损伤并降低脓毒症的死亡率。