非小细胞肺癌组织中miR-203启动子DNA甲基化状态与 SRC表达及临床病理因素的相关研究

左淑润 杭文璐 薄芸 孔丽萍 李海泉

肺癌是全球发病率和死亡率最高的肿瘤之一,尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌总数的80%[1],其预后不良仍然是困扰临床的难题。miRNA-203是微小RNA中的一种,有研究证实,其在肺癌中为抑癌基因[2],其可特异性识别并结合目标 mRNA 的3′-UTR[3],在转录后水平调节 mRNA 的降解或抑制其翻译,此外,miRNA-203 启动子区受到DNA甲基化的调控[4],影响其转录活性。前期,通过生物信息学软件预测和文献调研发现 miRNA-203是SRC蛋白的调控因子,SRC蛋白是一种非受体酪氨酸蛋白激酶,由原癌基因c-SRC编码[5],在肺癌细胞中过表达,但miR-203的表观遗传学改变是否会影响SRC的表达尚未明确。因此,本研究计划分析新鲜的肺癌组织和相应的癌旁组织的miRNA-203启动子DNA甲基化水平、miRNA-203和SRC的表达水平及与临床病理因素之间的相关性。旨在探讨miR-203基因启动子区DNA甲基化在肺癌发生发展中的作用及机制。

资料与方法

一、研究对象

选择2022年12月至2023年6月在徐州医科大学第二附属医院手术切除的NSCLC标本45例以及其对应的癌旁组织(距肿瘤边缘>5cm),同时收集患者的临床病理资料。所获得的标本需满足以下要求:(1)术后至少经两位病理学专家确认为NSCLC,并按照国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control,UICC)分类标准[6]进行分期。(2)在手术前,患者没有其他恶性肿瘤病史,并没有接受任何相关治疗,包括手术、放化疗或内分泌治疗等。(3)患者及其家属充分理解并签署了相关知情同意书。(4)患者的个人资料和临床病理信息需完整。本研究已通过徐州医科大学第二附属医院伦理委员会的审查批准(2021-120203)。

二、实验方法

1. Real-time PCR检测miR-203基因表达情况

首先,将组织加入Trizol试剂盒(TIANGEN, Beijing, China)中的裂解液进行研磨,以提取总RNA。提取完成后,使用Nano Drop 2000C紫外分光光度计检测RNA的质量,选择A260/280nm比值在1.8至2.0之间的5μg/L的RNA为模板进行逆转录。根据www.applied-science.roche.com网站的Primer Finder数据库设计了miR-203引物序列,并委托上海生物工程公司(Shanghai,China)合成。PCR反应体系总体积为20μL,包含2μL特异性引物、8μL DNA模板和10μL LC480 SYBR Green I Mastermix。PCR反应开始时,在95℃进行5分钟的预变性,然后经过三步扩增周期(95℃ 5秒,50℃ 15秒,72℃ 5秒),重复循环45次。所有样本均进行了3次重复实验,取平均值。使用U6 snRNA作为内部参考基因,对数据进行归一化处理。采用2-ΔΔCT法来比较miRNA-203的相对表达水平。miRNA-203的引物序列5′-GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA-3′(反向)5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′。qRT-PCR反应特异性由熔解曲线判断,若呈单峰则特异。

2. miR-203 基因启动子区及 CpG 岛的预测

通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)UCSC(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi)等基因组数据库获取了miR-203基因序列,并进行了相应的基因启动子调控区域和CpG岛的预测。(图1)根据结果,设计出合适的甲基化特异性引物和非甲基化引物(表1)。

表1 MSP引物序列

图1 miRNA-203启动子区CpG 岛预测

3. 甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)分析miR-203启动子DNA甲基化状态并经过亚硫酸氢盐(bisulfite sequencing PCR,BSP)测序验证

先将癌组织及癌旁正常组织在液氮中充分研磨,然后按照DNA提取试剂盒说明书(TIANGEN,Beijing,China)中的顺序提取DNA,再用EZ DNA Methylation -DirectTM Kit(ZYMO RESEARCH,USA) 试剂盒对1.5～2.0 μL DNA样本进行亚硫酸盐修饰,在PCR仪上进行,修饰条件:98 ℃ 8 min,64 ℃ 3.5h,4℃储存20 h。根据试剂盒中的纯化试剂说明书,对修饰完成的DNA进行纯化操作。完成纯化后,将DNA置于-20℃的冰箱中进行保存,以备后续使用。以修饰后的DNA模板配置25μL的MSP反应体系,PCR Mix 12.5μL,引物上、下 游 分 别 为1μL,DNA 模 板 2 μL,ddH2O 8.5 μL。扩增条件:预变性95℃ 5 min;变性95 ℃30s,退火30s,延伸72℃ 30 s共38个循环;72 ℃10 min。取15μL PCR 扩增产物,在120V进行琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像仪观察、分析电泳条带。同时将组织样本送至上海生工生物工程有限公司进行BSP测序。

4. 免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)测定组织中SRC蛋白的表达

取手术切除的NSCLC癌组织及其对应的癌旁组织(距离肿瘤组织边缘>5厘米)。使用10%中性甲醛进行固定,并进行了常规的脱水、透明处理,将组织样本进行石蜡包埋。制备连续切片,每片厚度为4μm。接着,将切片放入80℃的烤箱中加热30分钟,用二甲苯进行脱蜡处理。随后进行梯度乙醇脱水。为了进行抗原修复,将切片浸泡在0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液中加热处理,并自然冷却至室温。使用10%正常山羊血清进行封闭处理,孵育30分钟后加入稀释比例为1 ∶50的兔抗人SRC单克隆抗体,4℃过夜孵育。接下来,加入生物素标记的鼠抗兔IgG二抗,在37℃孵育30分钟。使用DAB显色后,进行苏木素复染。进行梯度乙醇脱水处理,使用二甲苯进行透明化,并最后使用中性树胶进行封片。使用PBS作为阴性对照,用已知含有SRC蛋白的阳性对照切片作为阳性对照。

由两位病理科医师采用双盲法独立阅片。IHC评分以染色强度和阳性细胞百分率为依据,强度评分为0(无染色)、1(弱染色)、2(中染色)、3(强染色);其比例评分分别为:0(<5%阳性细胞),1(6%～25%阳性细胞),2(26%～50%阳性细胞),3(51%～75%阳性细胞)和4(>75%阳性细胞)。两项评分乘积≥1 为 SRC蛋白阳性表达。

三、统计学分析

结 果

一、miR-203在肺癌组织与癌旁组织中的表达差异

根据文献调研提示miR-203在肺癌细胞中低表达,利用 qRT-PCR 技术进一步对 45例肺癌组织及其配对的癌旁组织中miR-203表达水平进行了检测。结果显示(图2),NSCLC组织中miR-203平均表达水平(0.83±0.12)与癌旁组织(1.05±0.23)相比明显降低,差异有统计学意义(t=-0.348,P=0.003)。

图2 miR-203在NSCLC癌组织与癌旁组织中的相对表达量及差异(**P<0.01)

二、miR-203基因启动子 DNA 甲基化水平在非小细胞肺癌组织与癌旁组织中的差异

MSP结果显示(图3),在45份癌组织标本中,有30份发生甲基化,甲基化率为66.67%;在其对应的癌旁组织中有11例发生了甲基化,甲基化率为24.44%,两者相比较,差异有统计学意义(χ2=16.172,P<0.001)。

图3 MSP检测miR-203启动子DNA甲基化结果

三、癌组织与癌旁组织中miR-203基因启动子CpG岛甲基化程度测序结果

部分癌组织中miR-203基因启动子测序结果提示其启动子区的平均甲基化水平为86.6%(65/75),相对应的癌旁组织的miR-203的平均甲基化水平为18.7%(14/75),两者相比差异具有统计学意义(χ2=69.558,P<0.001)(见图4)。

图4 部分癌与癌旁组织miR-203启动子区域甲基化情况简化图

四、SRC 蛋白在非小细胞肺癌组织与癌旁组织中的差异

应用文献调研并结合MIRDB数据库(http://www.mirdb.org/)搜索miR-203的靶向基因,对靶基因进行筛选,发现SRC 的 3′-UTR 与 miR-203 的 5′端有相互匹配的连续区域(图5A)。对癌组织与癌旁组织进行IHC分析(图5B),发现癌组织SRC的阳性率为68.89%(31/45),与癌旁组织SRC的阳性率为33.33%(15/45)相比差异有统计学意义(χ2=11.383,P=0.001)。

图5 SRC在癌组织与癌旁组织中的表达差异

五、肺癌组织中 miR-203 DNA甲基化与miR-203、SRC蛋白表达的相关性

使用统计学方法评估NSCLC中miR-203启动子DNA甲基化、miR-203表达和SRC表达之间的相关性。结果提示,在非小细胞肺癌组织中 miR-203 启动子区 DNA 甲基化水平与 miR-203 表达水平呈负相关(Spearman相关系数rs=-0.615,P=0.021),而与 SRC的表达则呈显著正相关(Spearman 相关系数rs=0. 703,P=0.002 );其次,miR-203 表达水平与 SRC 表达呈显著负相关(Spearman 相关系数rs=-0.579,P=0.001)。

六、miR-203 DNA甲基化与非小细胞肺癌患者临床病理参数的关系

结合患者的临床病理资料发现miR-203 启动子区DNA甲基化阳性率在肿瘤直径大于等于 3cm 组高于肿瘤小于 3cm 组(χ2=4.602,P=0.032);浸润性腺癌的甲基化阳性率明显高于微浸润腺癌(χ2=10.153,P=0.001);在临床TNM分期中,分期较高组高于分期较低组(χ2=4.849,P=0.028),差异均有统计学意义;而与年龄、性别、肿瘤位置、病理分型等因素之间的差异没有统计学意义(见表2)。

表2 肺癌组织中miR-203启动子DNA甲基化与临床病理特征的关系[n(%)]

讨 论

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长度约为 20个核苷酸的内源性非编码小 RNA,在调节细胞周期、基因表达以及生物个体发育等方面发挥着重要的功能[7]。miR-203位于人类染色体14q32.33的一个区域,已被证明与多种癌症的发生相关[8],本研究发现在非小细胞肺癌组织中 miR-203表达显著低于配对癌旁组织,发挥着抑癌基因的作用,差异有统计学意义,这与之前的研究结果是相一致的[9];然而其表达水平的降低是否是表观遗传学改变导致的,目前在肺癌组织中未见报道。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在《早期肺癌诊断中国专家共识(2023年版)》[10]中着重介绍了肺癌甲基化在早期诊断中的应用。目前的研究已经指出[11],联合检测肺泡灌洗液中的SHOX2和RASSF1A基因甲基化,相较于细胞学检查和血清生物标志物如癌胚抗原,对肺癌的整体诊断效果更为显著。另外一项研究也表明[12],在这两个基因的甲基化PCR联合检测中,任何一个阳性结果都能够将肺腺癌和鳞癌的检出率分别提升至66.0%和90.9%。这些相关检测方法已经成功应用于临床实践中。

然而,关于miRNA的甲基化检测仍处于初期研究阶段,分子水平的甲基化检测为癌症的诊断和治疗提供了新的研究思路。miRNA通过调节与启动子相关的CpG岛的高甲基化或低甲基化,来控制抑癌miRNAs或致癌miRNAs的表达[3]。以miR-203为例,在乳腺癌、前列腺癌、肝癌和血液系统恶性肿瘤中,miR-203作为抑癌基因由于启动子的高甲基化,其表达通常会被下调[13-16]。Du等人的研究还发现[17],在胃癌细胞中,miR-203和miR-375的CpG岛甲基化与miRNAs的表达呈负相关。然而在胃癌组织中,这种关系并不明显,考虑到细胞的杂合性可能是组织样本中甲基化表达关系不一致的原因。另外,彭恒等人在肺癌细胞中的研究[18]表明,miRNA-203的低表达与其启动子的高甲基化有关。但到目前为止,在NSCLC组织中,尚未见有相关报道。因此,本研究检测了miR-203在45例NSCLC癌与癌旁组织中的差异,结果发现,与癌旁正常组织相比较,肺癌组织中 miR-203基因启动子区 DNA 甲基化水平显著增加,而其表达水平显著下调; 同时,通过相关性分析发现肺癌组织中 miR-203 DNA 甲基化水平与其表达水平呈负相关。

miRNAs的甲基化改变可能导致下游增殖或凋亡相关的癌蛋白异常表达,本研究发现 miR-203 可能是SRC蛋白的重要调控因子,SRC是一种非受体酪氨酸激酶,它通过参与多条信号通路,在肿瘤、炎症及自身免疫性疾病中发挥作用[19]。通过相关性分析发现NSCLC组织中的miR-203甲基化水平与SRC表达呈显著正向关联,这表明miR-203基因启动子区的甲基化状态可能与SRC蛋白的表达调控相关,这对于了解miR-203的整个网络调控系统,并进行有针对性的干预具有重要意义。此外,研究还观察到miR-203基因启动子区的甲基化与肿瘤直径、腺癌的浸润程度以及TNM分期等临床病理因素之间存在相关性。这提示甲基化状态可能参与肿瘤侵袭和转移过程,并有可能影响预后。

综上所述,本研究结果表明miR-203基因启动子区DNA甲基化与肺癌的发生和发展密切相关,可能作为潜在的生物标记物用于肺癌的早期诊断和预后评估。这些结果为进一步深入研究miR-203在肺癌中的功能和调控机制提供了重要依据,并为开发新的肺癌治疗策略提供了理论支持。