抗ACCase 抑制剂类除草剂水稻种质的创制与鉴定

吴丹丹 许敏敏 刘兆明 梁 静 马 引 李 峰 李 娟

（合肥戬谷生物科技有限公司，安徽合肥 230031）

水稻是我国三大主粮之一，水稻稳产对我国粮食供应和社会稳定具有至关重要的作用。杂草为农业生产的生物逆境之一，与虫害、病害等共同危害着农业生产。农田杂草的发生不仅妨碍农事操作，而且与作物争夺土壤养分、光照、水分、空间等资源，滋生病虫害，严重影响了全球粮食作物的产量和品质，造成了巨大的经济损失[1]。除草剂是目前最主要的除草手段，具有高效、经济、省力的优点，能有效防控杂草[2]。但是，杂草与农作物共同生长在农田中，除草剂使用不当必然对农作物造成一定伤害，极容易导致对除草剂敏感的作物死亡[3]。此外，稻田杂草抗药性问题日趋严重，据统计，我国每年由杂草引起的水稻产量损失约1000 万t[4]。因此，创制和利用具有除草剂抗性的水稻品种尤为重要，是降低杂草危害、防治稻田杂草最经济有效的措施。

乙酰辅酶A 羧化酶（ACCase）是催化脂肪酸从头合成反应中第一步的限速酶，在合适的条件下可以催化乙酰辅酶A 生成丙二酰单酰辅酶A[5]，是生物不可缺少的酶。乙酰辅酶A 羧化酶自1958 年被发现可以作为除草剂的靶标酶之后，得到了广泛的应用。以ACCase 作为靶标的除草剂，造成植物死亡的方式是抑制稗草等禾本科植物体内的脂肪酸合成，而对阔叶作物安全无害[6]，且具有高效、低毒、对后茬作物安全等特点[7]。研究发现，水稻OsACC基因某些位点的突变可以赋予其对ACCase 抑制剂类除草剂的抗性，江苏省农业科学院张保龙团队通过筛选发现，水稻OsACC基因第1796、2015、2038、2052、2089、1796、1731、2276 位氨基酸发生突变，可对高效盖草能、喹禾灵等除草剂产生抗性[8-10]。Xu 等[11]通过先导编辑方法结合抗性筛选获得OsACC基因第2125 位氨基酸突变体。

甲磺酸乙酯（EMS，Ethyl methanesulfonate）作为效果显著且负面影响小的化学诱变剂，被广泛应用于构建具有优良性状的水稻突变体[12-14]，在水稻抗除草剂资源创制及筛选中也起到至关重要的作用。王俊梅等[15]利用辐照和EMS 诱变84 份水稻材料，通过草甘膦的筛选获得了5 份耐草甘膦水稻遗传资源。广东创新科研团队通过化学诱变筛选方法研发出非转基因抗除草剂材料洁田稻[16]。顾佳清等[17]利用EMS 处理粳稻品种中花11，从诱变的水稻群体中筛选出高产的突变体，经过后代的纯化，得到了可以直接推广应用的水稻突变新品系申化1 号。江群等[18]利用EMS 诱变水稻品种镇糯19，创制出抗乙酰辅酶A 羧化酶抑制剂类除草剂种质。陈天子等[19]以9311 为受体材料，利用EMS 诱变的方法创制出抗咪唑啉酮除草剂种质。

本研究通过EMS 诱变水稻种子，然后通过植物组织培养的方法在培养基中添加ACCase 抑制剂类除草剂氟吡甲禾灵对愈伤组织进行筛选，并分化再生获得了抗性植株，通过测序分析明确其突变类型并移栽大田自交收获M2种子，之后在正季对M2种子进行大田抗性水平鉴定以及重要农艺性状鉴定，为水稻抗除草剂育种提供了新的种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂供试水稻材料R1010 由安徽未来种业有限公司提供，是已审定水稻品种未两优10号的父本，对本研究中所用除草剂高效盖草能没有抗性。所用试剂及除草剂相关信息见表1。

表1 本试验所用试剂

1.2 水稻种子EMS 诱变、组织培养及抗除草剂突变体筛选取R1010 水稻种子50g，用清水浸泡2h，接着用5mg/mL 的EMS 水溶液浸泡14h，之后再用硫代硫酸钠中和20min，诱变处理之后在无菌工作台对种子进行消毒处理。先用75%乙醇消毒90s，用无菌水冲洗干净之后，再用50%的84 消毒液振荡消毒30min，用无菌水冲洗干净接种于不加筛选剂的愈伤诱导培养基上并置于28℃培养室恒温培养。每天保持18h 光照和6h 黑暗。培养20d之后，将长出来的愈伤组织转移至加有除草剂氟吡甲禾灵（0.25g/L）的筛选培养基进行第1 轮抗性筛选，2 周后，将抗性小颗粒转移至加有氟吡甲禾灵（0.5g/L）的筛选培养基进行第2 轮抗性筛选。第2轮抗性筛选2 周后，将筛选出来的抗性愈伤小颗粒转移至加有氟吡甲禾灵（0.25g/L）的愈伤分化培养基，让抗性愈伤组织再生成抗性植株。

1.3 抗除草剂突变体ACCase 基因的序列分析通过在国家水稻数据中心数据库输入基因号LOC_Os05g22940，获得ACCase基因的序列，并根据其保守序列在NCBI 网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）在线设计特异性扩增引物，具体引物序列见表2。将再生的抗性单株生根培养，单株标号并取叶片，使用传统CTAB 法[20]提取基因组DNA 并用已提取的基因组DNA 作为模板，用设计的引物加上KOD mix 分别扩增基因片段，之后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测分析，并将条带正确的PCR 产物送生工生物工程有限公司进行测序。使用SnapGene 6.0.2 软件分析测序结果，分析突变体与野生型的ACCase基因碱基差异并确定产生除草剂抗性的ACCase突变位点。

表2 ACCase 基因扩增引物序列

1.4 抗除草剂突变体的抗性水平鉴定及农艺性状调查经过序列分析将确定突变位点的单株移栽大田并单株收获得到M2种子，正季在安徽未来种业有限公司舒城水稻基地进行除草剂抗性水平鉴定试验，5 月上旬播种，6 月上旬移栽，突变体和野生型材料R1010 分别移栽264 个单株，24 行，11列，行距0.27m，株距0.17m。对突变体和野生型材料R1010 喷施清水和3 个不同浓度的高效盖草能：2 倍（60mL/667m2），4 倍（120mL/667m2），6 倍（180mL/667m2）。田间肥水使用参照常规大田管理。分别在除草剂喷施后的第21 天以及黄熟期对突变体及野生型材料R1010 进行农艺性状统计调查。

2 结果与分析

2.1 抗除草剂突变体筛选用加有除草剂氟吡甲禾灵的培养基对5000 颗水稻愈伤组织进行筛选4 周后，非抗性愈伤组织基本停止生长并褐化甚至死亡，而只有25 颗抗性愈伤组织生长旺盛并长出很多鲜黄色的次生小颗粒。抗性愈伤组织在加有氟吡甲禾灵的分化培养基上继续分化培养，24 颗愈伤组织都褐化并停止生长，只有1 颗愈伤组织再生出新的抗性植株（R1010-W2125C），将抗性植株转移至生根培养基中直接生根壮苗，见图1。

图1 组织培养筛选抗性水稻突变体

2.2 突变体的ACCase 基因序列分析为确定唯一的一株抗性植株的突变位点以及突变类型，使用14 对引物对野生型材料R1010 以及突变体材料的ACCase基因分别进行扩增，都获得了预期大小的片段（图2）。

图2 R1010 野生型和突变体中OsACC 基因的PCR 扩增结果

分别以野生型R1010 以及抗除草剂突变体的DNA 为模板扩增的PCR 产物经一代测序分析和比对，发现与野生型ACCase基因开放阅读框（ORF）相比，突变体ACCase基因中存在一个点突变，其开放阅读框的第6375 位碱基由G 突变成C，从而引起编码的第2125 位氨基酸由色氨酸突变为半胱氨酸（图3）。

图3 R1010 野生型和突变体中OsACC 基因序列的比对结果

2.3 M2 抗性水平鉴定及农艺性状调查野生型R1010 与抗除草剂突变体R1010-W2125C在不同浓度高效盖草能喷施后表现出明显差异，喷施除草剂3d 之后，野生型植株心叶开始死亡，到3 周左右整个植株逐步枯死，而突变体植株在4 种不同浓度的除草剂高效盖草能喷施后依然生长旺盛，没有药害。

成熟期对野生型空白对照以及抗除草剂突变体进行农艺性状调查，发现在株高、全生育期、抽穗期、有效穗数、穗长、每穗粒数、千粒重、结实率等农艺性状上野生型空白对照与突变体无显著差异（表3）。

表3 野生型R1010 及抗除草剂突变体R1010-W2125C 田间喷施不同浓度除草剂后的农艺性状

3 讨论

近年来，随着社会经济的发展，水稻的生产模式正在发生巨大变革，水稻直播在生产中越来越普遍，伴随直播而产生的稻田草害和杂草稻已成为制约水稻生产提质增效的关键问题。为了缓解稻田草害问题，抗除草剂水稻新种质的创制已成为迫切需求，各大高校和科研院所利用转基因、物理化学诱变以及基因编辑等技术手段创制了一系列抗除草剂水稻种质，针对的除草剂类型包括草甘膦、草铵膦、咪唑啉酮类等。其中，草甘膦和咪唑啉酮类除草剂抗性水稻种质较多，草甘膦抗性水稻种质主要依赖转基因技术手段，但是目前在我国仍然受到监管，在生产应用上受到限制。抗咪唑啉酮类除草剂水稻种质多由物理化学诱变或者自然变异而来，可以推广应用，但是咪唑啉酮类除草剂在土壤中半衰期和残留期长，过量使用易对后茬作物造成药害，导致减产甚至绝产[21]。芳氧苯氧丙酸酯类除草剂则兼有高效、低毒、对后茬作物安全等特点，但水稻不抗ACCase抑制剂类除草剂，该类药物目前多在播种前作为田间封闭剂使用，且该类除草剂靶标位点单一，抗性杂草问题尤为严重。

本研究通过EMS 诱变水稻种子，并通过植物组织培养过程对诱变处理后的水稻种子进行愈伤诱导，之后用除草剂氟吡甲禾灵对愈伤组织进行3 次抗性筛选，获得抗ACCase 抑制剂类除草剂水稻植株，通过对ACCase基因进行测序分析，发现是由于ACCase基因开放阅读框的第6375 位碱基由G 突变成C 从而引起编码的第2125 位氨基酸由色氨酸突变为半胱氨酸，使得ACCase 抑制剂类除草剂不能作用于ACCase 蛋白，因而植株表现出对相应除草剂的抗性；后续通过对突变体M2材料进行抗性鉴定以及农艺性状调查，发现该突变材料可以抗6倍浓度盖草能乳油，且生长发育过程中农艺性状无显著变化，为水稻机械化生产提供了种质基础。本研究首次使用植物组织培养对抗除草剂突变体进行筛选，不仅减少了大量的田间种植和筛选的工作量，且在一定程度上减少了温度、天气、病虫害等外部条件因素的影响，极大地提高了筛选效率，后续还需要对该材料进行多浓度精准抗性鉴定，并与母本杂交进行配合力分析，培育抗ACCase 抑制剂类除草剂的水稻新品种。