澳洲坚果蛋白的酶法增溶工艺

缪福俊，刘润民，李文玕，廖永坚，郭刚军，宁德鲁

1.云南省林业和草原科学院（昆明 650201）；2.云南省热带作物科学研究所（景洪 666100）

澳洲坚果是世界著名坚果，也是我国重要的木本油料之一，种植面积已跃居世界第一位，在我国主要种植区域为云南、广西、广东、贵州[1-2]。澳洲坚果富含油脂、蛋白等营养成分，具有多种生物活性[3-4]。澳洲坚果饼粕（Macadamia nut cake，MNC）是澳洲坚果油工业的副产品，与其他油籽饼一样，MNC也是蛋白质的优质来源，蛋白质含量达30%，氨基酸比值系数分达86.95[5-6]。澳洲坚果蛋白主要由谷蛋白（63.18）、醇溶蛋白（14.95%）、球蛋白（14.58%）、清蛋白（7.29%）组成[7]。

然而，谷蛋白具有水不溶性的特点，导致其乳化性、起泡性等功能特性较差，严重限制其在饮料、营养蛋白等食品中的应用[8-9]。因此，必须对澳洲坚果蛋白进行增溶改性，才能将其广泛应用于食品中。生物改性中的酶解改性具有安全、快速、条件温和、易操作等优点，通过酶法改性能够改善植物蛋白的溶解性、起泡性、乳化稳定性等功能性质[10-11]。张氽等[12]研究大米蛋白在中性条件下的酶解增溶工艺，大米蛋白中游离氨基酸和肽含量显著增加，溶解性明显改善。澳洲坚果蛋白酶解增溶方面的研究还鲜有报道。因此，针对澳洲坚果蛋白富含谷蛋白导致溶解性差，传统碱溶酸沉工艺制备的蛋白粉存在含盐量高、口感差、色泽深等问题，试验采用绿色生物酶法结合纯物理提取技术从MNC中提取水溶性蛋白，确定适用于澳洲坚果速溶蛋白粉（Macadamia nut instant protein powder，MIP）增溶改性生产工艺，制备高溶解性MIP，以期为澳洲坚果蛋白的精深加工提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

澳洲坚果仁（云南省热带作物研究所）；中性蛋白酶（酶活力10万 U/g，庞博生物公司）。

全自动液压榨油机（6YY-280型，山东沂水阳东机械有限公司）；蛋白粉生产线（40 kg/d，云南省木本油料工程技术研究中心）；氨基酸自动分析仪（A300型，德国MembraPure GmbH公司）；全自动凯氏定氮仪（UDK-159型，意大利VELP公司）；高效液相色谱仪（2695型，美国沃特世公司）。

1.2 方法

1.2.1 澳洲坚果粕粉制备

采用全自动液压榨油机在室温条件下对澳洲坚果碎仁进行压榨制油，获得饼粕（蛋白含量26.40%）。采用粉碎机对饼粕进行粉碎，经胶体磨按料液比1∶1（g/mL）进行磨浆，获得澳洲坚果粕粉浆液。

1.2.2 酶法提取MIP流程

澳洲坚果仁→压榨→粕粉→磨浆→酶解→离心分离→蛋白液→喷雾干燥→蛋白粉

1.2.3 酶解条件的单因素试验

1.2.3.1 料液比

固定酶解温度50 ℃、酶解时间2 h、加酶量1.5%，在5个梯度的料液比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和1∶5 g/mL）条件下进行提取，测定水解度和溶解度，确定最佳料液比。

1.2.3.2 酶解温度

固定料液比1∶3（g/mL）、酶解时间2 h、加酶量1.5%，在5个梯度的酶解温度（40，45，50，55和60℃）条件下进行提取，测定水解度和溶解度，确定最佳酶解温度。

1.2.3.3 酶解时间

固定料液比1∶3（g/mL）、酶解温度50 ℃、加酶量1.5%，在5个梯度的酶解时间（1，2，3，4和5 h）条件下进行提取，测定水解度和溶解度，确定最佳酶解时间。

1.2.3.4 酶用量

固定料液比1∶3（g/mL）、酶解时间2 h、酶解温度50 ℃，在5个梯度的酶用量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）条件下进行提取，测定水解度和溶解度，确定最佳酶用量。

1.2.4 酶解条件的正交试验

在单因素试验基础上，选取L9(34)正交试验，考察料液比、酶解温度、酶解时间、酶用量4个因素对MIP溶解度的综合影响，正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素与水平

1.2.5 溶解度和水解度测定

1.2.5.1 溶解度

采用凯氏定氮仪检测酶解液中蛋白含量[12]。溶解度按式（1）计算。

1.2.5.2 水解度

采用茚三酮比色法测定[13]。水解度按式（2）计算。

1.2.6 MIP蛋白含量和氨基酸组成检测

依据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，采用全自动凯氏定氮仪测定MIP样品中蛋白质量分数；依据GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》，采用氨基酸自动分析仪测定MIP样品中17种氨基酸组成及质量分数。

1.2.7 MIP多肽分子量检测

采用高效液相色谱测定MIP样品分子质量。色谱条件：色谱柱TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流动相：乙腈-水-三氟乙酸40∶60∶0.1（体积比）；检测波长：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：30 ℃。

1.2.8 数据处理

采用Excel和SPSS软件进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 MIP提取工艺单因素试验结果

2.1.1 料液比对MIP水解度和溶解度的影响

蛋白质水解度影响蛋白质提取率，溶解度影响蛋白质水溶性，以水解度和溶解度为指标，研究MIP增溶改性的最佳工艺条件。研究料液比对MIP水解度和溶解度的影响，结果如图1所示。随着料液比的降低，MIP的水解度和溶解度逐渐增加，料液比1∶3（g/mL）时，二者达到最大值，这一比值继续降低时，出现下降趋势。说明溶剂的增加，一方面有助于水溶性蛋白的溶出，另一方面有助于增加蛋白质与酶分子作用位点，提高水解度和溶解度。

图1 料液比对MIP水解度和溶解度的影响

2.1.2 酶解时间对MIP水解度和溶解度的影响

进一步研究酶解时间对MIP水解度和溶解度的影响，结果如图2所示。在1～5 h范围内，MIP水解度和溶解度随着酶解时间延长而增加。酶解3 h后，水解度和溶解度增长缓慢，趋于平缓。综合增溶效果，酶解最适宜时间为3 h。

图2 酶解时间对MIP水解度和溶解度的影响

2.1.3 酶解温度对MIP水解度和溶解度的影响

酶解温度是影响MIP水解度和溶解度重要因素之一。由图3可知，在40～60 ℃范围内，水解度和溶解度呈现典型的峰形。随着酶解温度的增加，水解度和溶解度升高，到50 ℃时，达到最大值。

图3 酶解温度对MIP水解度和溶解度的影响

2.1.4 酶用量对MIP水解度和溶解度的影响

由图4可知，随着酶用量的增加，MIP水解度和溶解度不断增大。酶用量大于1.5%时，水解度和溶解度的增幅趋于平缓。考虑到生产成本，选取1.5%的酶用量。

图4 酶用量对MIP水解度和溶解度的影响

2.2 MIP提取工艺正交试验结果

依据单因素试验结果，采用正交试验进一步优化MIP提取工艺参数（表2）。MIP提取4个因素对溶解度影响的主次顺序为A＞B＞C＞D，即料液比＞酶解温度＞酶解时间＞酶用量，料液比对MIP溶解度影响最大，影响最小的为酶用量。最佳工艺条件为A2B2C2D3，即料液比1∶3（g/mL）、酶解温度50 ℃、酶解时间3 h、酶用量2.0%，对此最佳工艺进行中试生产实践。

表2 MIP制备正交试验结果

2.3 MIP提取工艺生产实践

2.3.1 工艺流程

MIP制备中试生产线位于云南省木本油料工程技术研究中心（云南省林业和草原科学院）。该生产线主要由胶体磨、酶解罐、卧式离心机、浓缩机、高压均质机、喷雾系统、包装机等组成，工艺流程如图5所示。

图5 MIP生产工艺

2.3.2 工艺实践

澳洲坚果饼粕粉制备：将澳洲坚果仁通过全自动液压榨油机进行压榨制油，获得脱脂饼粕，经粉碎机粉碎后制得粕粉。

磨浆：以20 kg粕粉为例，按料液比1∶1（g/mL）加入20 L软水，输送至胶体磨进行磨浆2～3次。

增溶改性：将浆料输送至酶解罐中，加入40 L软水（料液比1∶3 g/mL），开始搅拌（60 r/min）并加热至50 ℃，加入2%中性蛋白酶（400 g）进行酶解，3 h后升温至90 ℃进行灭酶活，降温至50 ℃时，将酶解液泵入卧螺分离机进行离心，固相可进行二次提取，液相泵入均质罐。

均质与喷雾干燥：将酶解液进行高压均质2次后，按一定流量泵入喷雾塔进行干燥（进风温度170～190 ℃、排风口温度70～85 ℃），获得MIP。MIP蛋白含量44.75%，蛋白得率44.11%，蛋白提取率74.77%，水解度7.23%，溶解度81.56%，说明正交试验模型拟合较好。通过工艺探索与实践，确定适用于MIP生产工艺参数和设备组成，为后续相关产品研发提供技术支撑。

2.4 MIP氨基酸组成

MIP游离氨基酸含量如表3所示。氨基酸总量为39.58 g/100 g，游离氨基酸含量达2 g/100 g的为Glu、Arg、Asp、Leu、Tyr和Gly。其中Glu含量最高，为9.09 g/100 g。试验表明，多肽中Glu、Arg、Asp、Gly和特异性氨基酸的含量与羟自由基的清除能力密切相关，Asp和Glu会显著增加抗氧化活性，如果缺失Asp和Glu会减弱抗氧化活性[14-15]。此外，Asp可以参与核苷酸代谢，促进细胞周期进程，改善机体生长性能[16]。试验中，MIP富含Glu、Arg、Asp等功能氨基酸，具有多种生物活性，有待进一步研究。

表3 MIP中游离氨基酸含量

2.5 MIP中肽段分子量范围

采用液相色谱方法检测MIP中肽段分子量分布，结果如图6所示。MIP中肽段分子量范围如表4所示。1000 Da以下的肽段占73.54%，0～500 Da范围肽段占62.84%，小于180 Da肽段占比35%。研究表明，分子量在1000 Da以下，氨基酸链长度在2～20个残基之间的小肽通常最活跃，因为与较大尺寸的肽相比，它们更容易被肠道吸收并渗透到细胞中[17]。检测结果表明，MIP中1000 Da以下的肽段达70%以上，蛋白中的活性序列在酶解过程中得到充分释放，有利于机体吸收。

图6 MIP多肽分子量测试峰图

表4 MIP中多肽段分子量范围

3 结论

在中性条件下，通过物理磨浆和酶解工艺研究MIP的制备工艺。在料液比1∶3（g/mL）、酶解温度50 ℃、酶解时间3 h、酶用量2.0%的工艺条件下，MIP蛋白含量44.75%，蛋白得率44.11%，蛋白提取率74.77%，具有较高的水解度（7.23%）和溶解性（81.56%）。此外，经酶解增溶，MIP中游离氨基酸和小分子肽段含量增加，赋予MIP多种生物活性功能，营养价值也得到明显改善，可应用于健康食品领域中。通过不断探索与创新，形成MIP制备的特殊工艺，为高品质蛋白粉的生产提供技术保障。