牛骨多肽酶解工艺优化及其抗氧化活性研究

白玉，周中驰，陈飞，朱太海，陈安徽，邵颖

1.南京爱莎香精有限公司（南京 210000）；2.徐州工程学院食品（生物）工程学院（徐州 221111）；3.江苏诺普乐生物科技有限公司（徐州 221116）

牛骨是我国肉牛产业的主要副产物之一，其中蛋白含量丰富，达16%～25%[1-2]。但是我国牛骨资源利用率较低，大部分牛骨被丢弃，不仅造成资源的浪费，也带来一定的环境污染压力，仅少部分牛骨被作为生产骨泥、骨粉、骨油、骨胶、骨汤等产品的原料，也有制作钙制剂和动物饲料的应用，总体牛骨产品附加值较低[3-4]。因此，如何有效利用牛骨资源并精深开发利用成为研究热点。

研究显示，牛骨中丰富的胶原蛋白经酶解分离纯化后所得多肽具有抗骨质疏松、促进成骨细胞增殖和抑制骨质流失等作用，对改善人体健康有重要意义[5-8]。因此采用生物技术手段，以牛骨为原料进行多肽物质的提取分离纯化研究成为牛骨资源深入开发的重要方向。胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶及风味蛋白酶都是酶解牛骨胶原蛋白的主要水解酶[9-12]。如：穆红等[13]探究超声辅助双酶法水解牛骨蛋白的最佳工艺，用中性蛋白酶与风味蛋白酶作为复合酶进行酶解，在最佳工艺条件下水解度达20.73%；吴晖等[14]利用碱性蛋白酶对牛骨进行酶解，结果发现当酶解产物平均分子量2025 Da时具有较强的抗氧化活性。

通过响应面设计试验对牛骨多肽复合酶解工艺进行优化，初步分离得到不同分子量多肽，并对多肽样品进行体外抗氧化活性检测，以期为牛骨资源的开发利用及牛骨类产品的精深加工提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜牛骨（购于徐州市雨润农贸市场）。

风味蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶（国药集团化学有限公司）；其余试剂为国产分析纯。

有机膜分离实验机（BONA-GM-18）、进口微滤膜元件（0.2 μm、16691）、进口超滤膜元件（5000 Da、16421）、进口纳滤膜元件（600 Da、16424；150 Da、16324）：济南博纳生物技术有限公司；扫描型紫外可见分光光度计（UV-1900PC，上海皓缇仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 牛骨泥的制备

新鲜牛骨剔除表面肌肉后粉碎成骨泥，装袋密封后于-20 ℃保存备用。

1.2.2 牛骨泥脱脂

采用高温蒸煮法脱脂，按照料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水，置于高压蒸汽灭菌锅内于121 ℃蒸煮10 min，取出后在4 ℃条件下冷却3 h去除表面油脂，备用。

1.2.3 多肽得率的测定

多肽质量浓度的测定：采用双缩脲法[15]测定多肽含量。分别准确吸取1 mL质量浓度3，4，5，6和7 mg/mL的标准蛋白溶液，加入5 mL双缩脲试剂与4 mL蒸馏水，避光反应30 min后于波长540 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。添加20 mL 10%三氯乙酸与20 mL多肽酶解液，充分混均，离心15 min，取1 mL上清液，加入5 mL双缩脲试剂与4 mL蒸馏水反应，于波长540 nm处测定吸光度，按式（1）计算多肽得率。

1.2.4 复合酶种类的确定

将风味蛋白酶（53 ℃）、酸性蛋白酶（45 ℃）、木瓜蛋白酶（55 ℃）、胃蛋白酶（37 ℃）、中性蛋白酶（40 ℃）、碱性蛋白酶（45 ℃）、胰蛋白酶（37 ℃）在其各自理论最适温度下，在加酶量1%、酶解时间2 h条件下对牛骨进行单酶酶解并计算多肽得率，确定多肽得率最高的2种酶作为复合酶。

1.2.5 复合酶比例的确定

对中性蛋白酶和胰蛋白酶按照1∶4，1∶1.5，1∶1，4∶1和1.5∶1的比例进行复配，复配后在加酶量1%、酶解时间2 h条件下对牛骨进行酶解并计算多肽得率，确定中性蛋白酶和胰蛋白酶的复配比例。

1.2.6 牛骨肽提取工艺优化

1.2.6.1 单因素试验

固定酶解参数温度45 ℃、酶解时间2 h，酶添加量2%、pH 7，以pH（pH 5，6，7，8和9）、酶添加量（1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%）、酶解温度（35，40，45，50和55 ℃）和酶解时间（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h）4个因素为单因素，在只改变某一因素的条件下进行单因素试验。

1.2.6.2 响应面提取工艺优化

在单因素试验基础上，选取酶添加量、酶解温度、酶解时间3个变量为影响因子，牛骨多肽酶解率为响应值，采用Design Expert 8.0.6.1设计三因素三水平试验，通过模型预测牛骨肽最优提取工艺。试验因素水平设计见表1。

表1 响应面设计试验因子及水平

1.2.7 牛骨肽不同分子量肽段的分离

牛骨酶解液通过孔径0.2 μm的微滤膜元件去除酶解液中的大分子物质后，依次通过截留分子量5000，600和150 Da的膜分离元件并收集相关组分，得到3个不同分子量组分，分别命名为组分Ⅰ（分子量＞5000 Da）、组分Ⅱ（600～5000 Da）、组分Ⅲ（150～600 Da）。制备成10 mg/mL多肽，备用。测定酶解原液与膜分离所得3个组分的多肽含量与抗氧化活性。

1.2.8 不同分子量牛骨肽抗氧化活性

1.2.8.1 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除能力测定参照魏洁琼等[16]的方法并改进。使用无水乙醇配制0.3 mmol/L DPPH溶液，取2 mL 10 mg/mL样品液与DPPH溶液，充分混合，避光反应20 min后于517 nm波长处测定吸光度，用A1表示。用同等体积的无水乙醇代替DPPH作为对照样，测定得到的吸光度用A2表示，用等体积的无水乙醇代替DPPH作为空白样，测定得到的吸光度用A0表示，DPPH自由基清除率按式（2）计算。

式中：A1为试验样吸光度；A2为对照样吸光度；A0为空白样吸光度。

1.2.8.2 羟自由基清除率测定

羟自由基清除率测定采用水杨酸法，参照项莹[17]的方法并加以改进。取8 mmo/L FeSO4和8 mmol/L水杨酸-乙醇溶液各1 mL，在反应体系中加入1 mL的10 mg/mL多肽样品溶液后加入1 mL的8.8 mmol/L H2O2启动反应，在37 ℃反应30 min后于波长510 nm处测定吸光度，用相同体积的去离子水代替样品溶液作为样品的本底吸收组，用相同体积的去离子水代替过氧化氢溶液作为对照组，羟自由基清除率按式（3）计算。

式中：A1为试验组吸光度；A0为对照组吸光度；A2为无显色剂时样品本底溶液的吸光度。

1.2.8.3 还原力测定

还原力测定采用铁氰化钾法，参照项莹[17]的方法并改进。取1 mL的10 mg/mL样品溶液加入3 mL的1%铁氰化钾溶液和同等体积的0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6），于50 ℃保温15 min。加入3 mL的10%三氯乙酸溶液，按4000 r/min离心5 min，离心后取3 mL上清液，并加入3 mL去离子水和0.5 mL 0.1%的氯化铁溶液，静置反应10 min后测定波长700 nm处吸光度，以等体积去离子水替代样品溶液作为空白对照。吸光度的大小与样品的还原能力呈正比。

2 结果与分析

2.1 酶的筛选

不同种类酶水解牛骨后的多肽得率如图1所示。6种蛋白酶分别酶解牛骨后酶解液中多肽得率均显著高于未加蛋白酶的空白组，其中中性蛋白酶与胰蛋白酶酶解后多肽得率最高，显著高于其他酶解液中多肽的得率，分别达到10.59%±0.21%和9.93%±0.19%。因此选择中性蛋白酶和胰蛋白酶进行复配以提高牛骨多肽得率。

图1 不同种类酶的多肽得率

2.2 复合酶复配比例的确定

中性蛋白酶和胰蛋白酶按照不同的比例进行复配并对牛骨进行酶解。图2结果显示：2种蛋白酶添加比例相近时，酶解液中多肽得率较低，可能是2种酶之间存在拮抗作用的结果；中性蛋白酶与胰蛋白酶任意一种酶比例较高时，协同作用占据优势，多肽得率明显上升。综合考虑工业化生产的经济成本等因素影响，最终确定：复合酶添加最佳比例为中性蛋白酶与胰蛋白酶的复配比例1∶4。

图2 不同比例复合酶的多肽得率

2.3 酶解工艺优化

2.3.1 酶解工艺单因素的确定

2.3.1.1 复合酶添加量的确定

考察复合酶不同添加量对牛骨多肽得率的影响。由图3结果可知，复合酶添加量1.0%～3.0%范围内，多肽得率呈先升后降趋势，复合酶添加量1.5%时，多肽得率达到最高，为14.44%±0.14%，加酶量1.5%～3.0%范围内呈下降趋势。因此牛骨多肽酶解的最佳加酶量为1.5%。

图3 复合酶不同添加量对多肽得率的影响

2.3.1.2 酶解时间的确定

酶解时间会影响牛骨多肽的得率。从图4可以看出，随着酶解时间的延长，多肽得率呈上升趋势，酶解时间0.5～2.0 h内牛骨多肽得率上升较为明显，酶解2 h后可能由于底物的大量消耗使其浓度降低，造成多糖得率变化较为平缓。因此最佳酶解时间为2 h，此时多肽得率达到最高，为15.11%±0.23%。

图4 不同酶解时间对多肽得率的影响

2.3.1.3 酶解温度的确定

由图5可知，酶解温度对牛骨多肽得率的影响显著。随着酶解温度的升高，多肽得率呈现先显著增加后显著下降趋势，酶解温度40 ℃时牛骨多肽的得率达到最高，为15.33%±0.10%，之后随着酶解温度升高，牛骨多肽得率显著下降。这应该与复合酶的最适反应温度有关，温度偏离酶的最适温度均会造成酶活力的下降，从而使得多肽得率降低。

图5 酶解温度对多肽得率的影响

2.3.1.4 酶解pH的确定

由图6可知，酶解环境pH在中性附近时牛骨多肽的得率较高，pH 7.5时多肽得率最高。但偏离中性环境时，偏酸或偏碱的条件下均使得复合酶的活性降低，造成多肽得率下降。中性环境有利于牛骨多肽的酶解，无需对酶解环境pH进行刻意调节，因此，试验不将pH作为响应面优化因素。

图6 不同pH对多肽得率的影响

2.3.2 响应面试验结果

2.3.2.1 响应面优化试验因素分析

在单因素试验结果基础上，选择对牛骨多肽得率影响较大的加酶量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）3个因素，以肽得率为响应值，根据响应面分析方法，设计三因素三水平试验方案，软件设计方案共17个试验点，其中12个分析试验，5个为中心试验。响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面设计试验结果

2.3.2.2 方差分析

根据试验得到二元多次回归方程：多肽得率=17.3-0.17A-0.19B+0.29C+0.11AB-0.34AC-0.11BC-1.02A2-1.32B2-0.82C2。如表3所示，试验选用的回归模型为差异极显著（P＜0.0001），失拟项中P值为0.13（P＞0.05），不显著。模型回归系数R2=0.9900，决定系数Radj2=0.9772，说明选用模型与实际相切合，并且方程对试验拟合度结果较好，根据表3中的P值可知，A、B对多肽得率的影响为差异显著，C则为差异极显著，并且加酶量与酶解时间的交互作用为差异极显著，3个因素对多肽得率的影响大小为酶解时间＞酶解温度＞加酶量。

表3 方差分析表

2.3.2.3 各因素交互作用响应面结果分析

图7为各个因素间的交互作用的等高线与3D曲面图。由图7（b）可知，酶解时间（C）与加酶量（A）之间的3D曲面图较为陡峭，等高线为椭圆形，可知这2个因素交互作用明显，与方差分析表结果一致。试验分析所得最佳工艺条件为酶添加量1.44%、酶解温度39.58 ℃、酶解时间2.10 h，预测所得多肽提取率17.35%。经综合考虑，条件修正为酶添加量1.40%、酶解温度39.6 ℃、酶解时间2.10 h，进行验证试验，3次平行所得验证试验结果为17.11%±0.24%，与预测值相差较小，说明该模型能较好预测牛骨肽提取最佳工艺。

图7 响应曲面图与等高线图

2.4 不同分子量多肽组分抗氧化活性

牛骨多肽酶解液经不同孔径膜分离处理后，截留获得3个分子量范围的肽段组分，分别为组分Ⅰ（多肽分子量＞5000 Da）、组分Ⅱ（600～5000 Da）、组分Ⅲ（150～600 Da），测定3个组分在牛骨酶解液中的含量同时对不同分子量组分和牛骨酶解液进行抗氧化检测。

由表4可知，牛骨酶解液中多肽分子量主要集中在600～5000 Da范围内，占比43.14%±0.23%，分子量150～600 Da范围内的较少，占比18.82%±0.15%。这可能是由于复合酶具有特定的酶切位点，所以分子量600～5000 Da范围内的肽段含量较高，而分子量150～600 Da范围内小肽含量较少。抗氧化活性结果显示，牛骨酶解液及不同分子量的多肽均有一定的抗氧化性，样品浓度均为10 mg/mL时，组分Ⅲ的DPPH活性最高，为87.89%±0.18%，组分Ⅲ的羟自由基清除活性最高，为52.49%±0.22%，组分Ⅲ的还原力最高，为0.382±0.02。3种不同分子量的多肽组分间抗氧化活性差别较小，组分Ⅲ（150～600 Da）的抗氧化活性高于其他组分，组分Ⅲ对DPPH自由基清除率可达87.89%，而牛骨酶解液的抗氧化性最弱，由此可知试验获得牛骨多肽分子量越小，其抗氧化活性越强。

表4 抗氧化试验结果

3 结论

采用响应面法优化牛骨多肽的最佳复合酶解工艺，其酶解条件为中性蛋白酶与胰蛋白酶复配比例1∶4、复合酶添加量1.40%、酶解温度39.6 ℃、酶解时间2.1 h，牛骨多肽得率17.11%±0.24%，多肽得率较未优化前提高11.61%。牛骨酶解液经过不同孔径膜分离后得到3种不同分子量范围的多肽，对3种不同分子量多肽及牛骨酶解液进行抗氧化活性验证，结果发现其均具有一定抗氧化活性，抗氧化活性大小排序为组Ⅲ（150～600 Da）＞组分Ⅱ（600～5000 Da）＞组分Ⅰ（＞5000 Da）＞牛骨酶解液，分子量较小的多肽较分子量大的多肽具有更强的抗氧化活性。试验以肉牛加工产业副产物牛骨为原料，对牛骨多肽的酶解工艺及酶解物的抗氧化活性进行研究，为牛骨多肽的制备提供有效方案，同时不同分子量牛骨多肽抗氧化活性的测定也为牛骨资源精深加工及精准开发提供依据。