黑果腺肋花楸多酚提取工艺优化及其抗氧化性研究

王亚菲，杜琳，潘勇韬，朱凤妹

1.河北科技师范学院（秦皇岛市 066000）；2.秦皇岛市林业局（秦皇岛市 066000）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）又名野樱莓[1-2]。20世纪90年代在我国辽宁开始引种栽培，具有食用价值、药用价值及经济价值[3-4]。黑果腺肋花楸果实中含有丰富的多酚类物质[5]，具有多种生物活性功能，如抗氧化性和抑菌作用。近年来，人们对黑果腺肋花楸的组分、保健作用及临床疗效的研究兴趣越来越大，国内对黑果腺肋花楸的研究大部分集中在活性物质的提取及开发利用。

黑果腺肋花楸果主要含有丰富的花青素、原花青素、黄酮醇等[6]，其次含有槲皮素、槲皮素苷和表儿茶素等[7]。原花青素含量最高，通常含有80%～95%的可提取原花青素[8]。黑果腺肋花楸果及其提取物具有预防尿路感染[5]、抗糖尿病[9]、抗癌作用、抑菌、治疗脂肪肝、抗动脉粥样硬化[10]等功效。

从植物基质中回收多酚的经典方法是使用酸化的甲醇、乙醇或丙酮水溶液进行溶剂萃取[11]。在相同条件下，在室温下使用纯水比有机溶剂-水混合物的提取水平低[12]。然而，提取产率可以通过超声处理[13]、加压液体提取[14]、脉冲电场处理[15]或植物细胞壁的酶降解[16]等技术提高。水超声处理提高工艺效率的主要原因是声空化现象及其产生的热效应和机械效应[17]，与传统技术相比，它可提高传质和显著破坏细胞壁，从而提供更高的提取率并显著缩短加工时间[18]。另外，为了提高多酚得率，常将两种或两种以上提取技术结合使用[19]。水作为提取溶剂，具有绿色环保、操作简单的优点，而且考虑到食用安全等问题，采用超声水提黑果腺肋花楸中的多酚并优化提取工艺，旨在为黑果腺肋花楸多酚的研究提供相关工艺技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果腺肋花楸果（辽宁富康源黑果花楸科技开发有限公司）；没食子酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；1 mol/L福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）：上海源叶生物科技有限公司；无水碳酸钠（天津欧博凯化工有限公司）；水杨酸（天津市鼎盛鑫化工有限公司）。

1.2 仪器与设备

KQ5200DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；V-5100可见分光光度计（武汉高精密科学仪器有限公司）；Star A1115型pH计[梅特勒-托利多（上海）有限公司]。

1.3 提取黑果腺肋花楸多酚

1.3.1 没食子酸标准曲线绘制

参考王淞[20]测定黑果腺肋花楸多酚的方法并稍作修改。配制1.0 mg/mL的没食子酸溶液，稀释至10，20，30，40，50，60和70 μg/mL 7个质量浓度。取定量稀释液于试管中，加入定量的10%福林酚试剂，避光反应5 min后，加入定量Na2CO3溶液，在30 ℃恒温水浴锅中避光静置1 h，测定波长765 nm处的吸光度，试验重复3次并绘制标准曲线。

1.3.2 多酚提取及得率测定

将黑果腺肋花楸果洗净，放入烘箱中烘干至果实表面无水滴。超声辅助提取后收集上清液，吸取1.0 mL上清液，按1.3.1小节的方法测定A765nm，多酚得率按式（1）计算。

式中：Y为多酚得率，mg/g；C为黑果腺肋花楸水提液多酚质量浓度，mg/mL；V为水提液体积，mL；N为稀释倍数；m为黑果腺肋花楸质量，g。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 料液比

准确称取20 g洗净的黑果腺肋花楸果，在超声功率200 W、提取温度40 ℃、提取时间25 min、pH 6.68的条件下，测定料液比1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70（g/mL）时多酚的得率，确定最佳料液比。每组试验平行3次，结果取平均值。

1.3.3.2 提取时间

称取20 g洗净的黑果腺肋花楸，按1∶50（g/mL）料液比加水打浆。控制超声功率200 W、提取温度40 ℃、pH 6.68，分别提取5，15，25，35和45 min，计算多酚得率并确定最佳提取时间。每组试验平行3次，结果取平均值。

1.3.3.3 提取温度

称取20 g洗净的黑果腺肋花楸，按1∶50（g/mL）料液比加水打浆。控制超声功率200 W、pH 6.68、提取时间25 min，分别测定20，30，40，50和60 ℃下多酚得率并确定最佳提取温度。每组试验平行3次，结果取平均值。

1.3.3.4 pH

称取20 g洗净的黑果腺肋花楸，按1∶50（g/mL）料液比加水打浆。控制超声功率200 W、提取时间25 min、提取温度40 ℃，分别测定pH在2.68，3.68，4.68，5.68和6.68下多酚得率并确定最适pH。每组试验平行3次，结果取平均值。

1.3.4 响应面试验

对水提黑果腺肋花楸多酚的单因素试验结果进行分析（SPSS 25.0），选择料液比、温度、pH这3个显著因素进行响应面试验，通过试验得出最优提取工艺。

表1 响应面试验因素及水平

1.4 黑果腺肋花楸多酚抗氧化活性测定

1.4.1 DPPH自由基清除率测定

参考叶树才等[21]的方法并稍作修改。吸取定量多酚溶液，加定量0.1 mmol/L DPPH溶液，静置30 min，在波长517 nm处测A1。吸取定量乙醇，加入定量DPPH溶液，静置30 min，在波长517 nm处测A0。吸取定量多酚溶液，加入定量乙醇，静置30 min，在波长517 nm处测A2。3次平行试验，VC代替多酚重复上述步骤。DPPH自由基清除率按式（2）计算。

式中：Y为DPPH自由基清除率，%；A0为空白组吸光度；A1为测定组吸光度；A2为对照组吸光度。

1.4.2 ABTS自由基清除率测定

参考赵彦巧等[22]的方法并稍作修改。将ABTS溶液（7.0 mmol/L）与K2S2O8溶液（2.5 mmol/L）等比例混合，避光放置过夜。将溶液吸光度调整至0.700±0.002，并在配制完成后的4 h内使用。反应体系：1 mL不同浓度黑果腺肋花楸多酚溶液+3 mL ABTS工作液，避光反应5 min后在波长734 nm处测A1；1 mL不同浓度黑果腺肋花楸多酚溶液+3 mL无水乙醇，避光反应5 min后在波长734 nm处测A2；1 mL无水乙醇+3 mL ABTS工作液，避光反应5 min后在波长734 nm处测A0。3次平行试验，VC代替多酚重复上述步骤。ABTS自由基清除率按（2）计算。

1.4.3 羟自由基清除率测定参考Zhang[23]的方法，将不同浓度多酚溶液、FeSO4、H2O2定量加入试管中，摇匀。静置10 min后加入定量水杨酸，10 min后在波长530 nm处测A1。在其他条件不变的情况下用去离子水代替H2O2，测定A2。在其他条件不变的情况下，用去离子水代替多酚溶液，测定A0。3次平行试验，同时做VC阳性对照。羟自由基清除率按（2）计算。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

没食子酸标准曲线见图1。回归方程式为y=0.0127x+0.0185，R2=0.9995，其中没食子酸质量浓度为x，吸光度为y。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 料液比对黑果腺肋花楸多酚得率的影响

如图2所示，多酚得率随料液比中液体占比的增大先上升后降低（P＜0.01）。1∶50（g/mL）时多酚得率最高，多酚在此时已经全部溶出。随着料液比中液体占比持续增大，伴随着黑果腺肋花楸多酚溶出，可能还有其他活性物质溶出，使多酚得率下降[27]，因此选择1∶40～1∶60（g/mL）进行后续试验较为合适。

图2 料液比对多酚得率的影响

2.2.2 提取时间对黑果腺肋花楸多酚得率的影响

如图3所示，提取时间对多酚得率影响不显著（P＞0.05）。随着时间的延长，超声的内能效应、机械效应加速了多酚穿过细胞壁大量溶出，但长时间的超声可能破坏了部分多酚的结构，导致多酚得率下降[28]。因此，后续试验中超声提取时间选择25 min较为合适。

图3 时间对多酚得率的影响

2.2.3 提取温度对黑果腺肋花楸多酚得率的影响

如图4所示，多酚得率随提取温度的上升呈先增后降趋势（P＜0.01）。当提取温度达到30 ℃时，多酚得率为0.94 mg/g。温度升高促进分子运动，使多酚与蛋白质等大分子结合不稳定，氢键断裂，加快多酚的溶出。温度过高破坏了多酚的结构，加速多酚氧化，使其含量降低，所以选择选择20～40 ℃进行响应面试验。

图4 温度对多酚得率的影响

2.2.4 pH对黑果腺肋花楸多酚得率的影响

如图5所示，随着pH的增大，多酚得率呈先上升后下降的趋势（P＜0.01）。pH为5.68时多酚得率最高，为0.72 mg/g，随着pH继续增大，多酚得率逐渐降低。这可能是因为多酚类物质在弱酸及中性环境下较稳定，过酸或过碱都会使多酚分解，从而降低多酚得率。所以选择pH 4.68～6.68进行响应面优化试验。

图5 pH对多酚得率的影响

2.3 响应面试验结果与分析

2.3.1 回归模型的建立及方差分析

回归模型设计及结果见表2。

表2 黑果腺肋花楸多酚响应面试验设计及结果

使用软件对响应面试验结果进行多项拟合回归，得到回归方程：

由表3可知，模型回归方程中F=85.02，P＜0.0001，该模型达到了极显著水平。失拟项（P=0.1051＞0.05）不显著，R2=0.9909，Radj2=0.9793，表明模型拟合度良好，可用于后续数据分析。变异系数为1.76%，说明试验具有较高的可信度。一次项A、B、C，交互项AC，二次项A2、B2、C2差异极显著（P＜0.01），说明这些因素对黑果腺肋花楸多酚得率影响很大。由F值可得，不同因素对黑果腺肋花楸多酚得率的影响大小为提取温度＞pH＞料液比。

表3 响应面回归模型方差分析

2.3.2 各因素交互作用

料液比与提取温度的交互作用，料液比与pH的交互作用及提取温度与pH的交互作用的响应面图及等高线图如图6所示。

图6 料液比、提取温度、pH之间交互作用的等高线及响应面图

响应曲面可以直观反映各因素对黑果腺肋花楸多酚得率的影响，曲面越弯曲说明交互作用越大；反之，曲面越平缓说明交互作用越小。颜色变化越快表明坡度越大，即对结果影响更显著。图6中AC曲面弯曲程度明显高于AB与BC，且坡度较陡；AC的等高线图显示出较细长的椭圆形，说明AC交互项具有显著影响。

2.3.3 验证试验

模型预测的提取黑果腺肋花楸多酚的最优工艺为料液比1∶53.07（g/mL）、提取温度34.14 ℃、pH 5.97，多酚得率为0.85 mg/g。进行验证试验时，结合实际操作及仪器精密度，将提取工艺调整为料液比1∶53（g/mL）、提取温度34 ℃、pH 6。按此条件平行3次，测得实际多酚得率0.84 mg/g。说明该模型精确可信，可用于黑果腺肋花楸多酚的提取工艺优化。

2.4 黑果腺肋花楸多酚抗氧化活性测定结果与分析

2.4.1 DPPH自由基清除率测定

DPPH外观呈深紫色，抗氧化剂会与其电子配对，进而使溶液颜色变成浅黄色或无色，根据颜色的变化可以判断抗氧化剂的抗氧化能力。如图7所示，随着多酚溶液浓度的增加，DPPH自由基清除率显著增大（P＜0.05）。溶液质量浓度为10 mg/mL时，多酚对DPPH自由基清除率（97.59%）大于VC对照组（96.33%），说明多酚具有良好的清除DPPH自由基的能力。

图7 黑果腺肋花楸中多酚类物质对DPPH自由基的清除能力

2.4.2 ABTS自由基清除率测定

ABTS法是一种被广泛用于检测物质体外抗氧化能力的方法。如图8所示，ABTS自由基清除率随着多酚溶液质量浓度的增大呈极显著（P＜0.01）增大的趋势。溶液质量浓度为2 mg/mL时，多酚对ABTS自由基清除率（89.41%）略低于VC对照组（99.6%），说明多酚具有一定的清除ABTS自由基的能力。

图8 黑果腺肋花楸中多酚类物质对ABTS自由基的清除能力

2.4.3 羟自由基清除率测定

水杨酸能快速捕捉羟自由基，通过测定吸光度可以判断抗氧化剂的抗氧化性。如图9所示，羟自由基的清除率随着多酚浓度的增大而逐渐增大（P＞0.05）。当质量浓度为6 mg/mL时，羟自由基清除率（81.56%）低于VC对照组（99.64%），说明多酚具有一定的清除羟自由基的能力。

图9 黑果腺肋花楸中多酚类物质对羟自由基的清除能力

3 结论

通过单因素试验及响应面试验获得最优提取工艺：料液比1∶53（g/mL）、提取温度34 ℃、pH 6、提取时间25 min。按最优提取工艺提取黑果腺肋花楸多酚，得率为0.84 mg/g，与预测值相近，表明该模型可靠。分析黑果腺肋花楸多酚的抗氧化活性，结果表明：多酚对DPPH自由基（97.59%）、ABTS自由基（89.41%）、羟基自由基（81.56%）具有良好的清除能力，黑果腺肋花楸多酚具有良好的抗氧化能力，为黑果腺肋花楸多酚的提取及保存提供理论依据。