蓝莓清汁复合酶解工艺优化

孙瑞悦，张见，李彩铃，刘元法,2

1.白马未来食品研究院（南京 210095）；2.江南大学（无锡 214000）

蓝莓（Blueberry）属于杜鹃花科越桔属，果实呈蓝色，外含一层白色果粉，果肉细腻，风味独特，口感酸甜，被誉为“浆果之王”[1]。蓝莓果实中含有丰富的营养成分，如花青素、黄酮、维生素、超氧化物歧化酶（SOD）、膳食纤维等多种生理活性物质[2]，具有抗氧化[3]、增强机体免疫[4]、缓解眼部疲劳[5]、降血糖[6]等多种功能。

蓝莓除少数用作鲜食外，大多数被加工成各种产品[7]。我国起步较晚，主要将其加工成果汁[8]、果酱[9]、果酒[10]等，相对而言，果汁类产品少，市售果汁主要以果肉饮料和浓缩汁为主。而有一部分人认为果肉饮料和浓缩汁的口感过于浓厚，他们更青睐于清淡口味，因此为丰富蓝莓果汁的种类，研制蓝莓清汁饮料以填补市场空白。

此研究旨在通过复合酶酶解制备出汁率高、花青素含量高的蓝莓清汁饮料，为蓝莓清汁的开发利用提供理论数据，加快实现蓝莓清汁饮料的工业化生产。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

蓝莓（江苏中植生态植物科学研究院有限公司）；食品级果胶酶（30000 U/g）、食品级纤维素酶（10000 U/g）、食品级半纤维素酶（30000 U/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；飞燕草色素标品（纯度99.4%）、矮牵牛色素标品（纯度99.8%）、芍药素标品（纯度98.5%）：德斯特生物有限公司；矢车菊色素标品（纯度96.7%，上海安谱实验科技股份有限公司）；天竺葵色素标品（纯度98.8%纯度，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；锦葵素标品（纯度97.4%，上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

5500+液相色谱-质谱联用仪（德国SCUEX）；TM6多功能小美料理机：福维克家用电器制造（上海）有限公司；ARD110电子天平、AX224ZH/E分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；LYNX4*1 L离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；HHS-21-6恒温水浴锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程蓝莓冻果→清洗→4 ℃解冻→沥干→破碎打浆→酶解→钝酶→离心→蓝莓清汁

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 原料预处理取-20 ℃冷冻蓝莓果，挑弃冻瘪和含有枝干的果，用自来水洗去表面灰尘。

1.3.2.2 打浆

采用多功能料理机进行打浆破碎（浆果与水比例1∶4）。

1.3.2.3 酶解、钝酶、离心

根据浆汁总质量称取一定比例的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶，置于50 ℃恒温水浴锅中，酶解2 h，于85 ℃灭酶10 min，后在5000 r/min转速下离心15 min，得蓝莓清汁。

1.3.3 酶解工艺优化试验

1.3.3.1 果胶酶添加量对酶解效果的影响

分别称取6份50 g蓝莓浆果，在酶解温度50 ℃、酶解时间2 h条件下，考察不同果胶酶添加量（0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%）对蓝莓清汁出汁率和花青素溶出率的影响。以蓝莓出汁率、花青素含量作为评价指标，每个试验重复3次，确定果胶酶的最适添加量。

1.3.3.2 纤维素酶添加量对酶解效果的影响

分别称取6份50 g蓝莓浆果，在酶解温度50 ℃、酶解时间2 h条件下，考察不同纤维素酶添加量（0.02%，0.06%，0.1%，0.14%，0.18%和0.22%）对蓝莓清汁出汁率和花青素溶出率的影响。以蓝莓出汁率、花青素含量作为评价指标，每个试验重复3次，确定纤维素酶的最适添加量。

1.3.3.3 半纤维素酶添加量对酶解效果的影响

分别称取6份50 g蓝莓浆果，在酶解温度50 ℃、酶解时间2 h条件下，考察不同半纤维素酶添加量（0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%和0.12%）对蓝莓清汁出汁率和花青素溶出率的影响。以蓝莓出汁率、花青素含量作为评价指标，每个试验重复3次，确定半纤维素酶的最适添加量。

1.3.3.4 复合酶配比正交优化试验

通过单因素试验确定果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶的最适添加范围，在酶解温度50 ℃、酶解时间2 h条件下，以3种酶的不同添加量设计L9(33)正交试验，确定复合酶最佳配比，试验设计如表1所示。

表1 复合酶因素水平 单位：%

表2 响应面试验因素水平设计

1.3.3.5 酶解温度对酶解效果的影响

分别称取6份50 g蓝莓浆果，固定复合酶添加量（果胶酶添加量为0.15%，纤维素酶添加量为0.08%，半纤维素酶添加量为0.08%）、酶解时间2 h，考察不同酶解温度（35，40，45，50，55和60 ℃）对蓝莓出汁率和花青素含量的影响。以蓝莓出汁率和花青素含量作为评价指标，每个试验重复3次，确定酶解的最适温度。

1.3.3.6 酶解时间对酶解效果的影响

分别称取6份50 g蓝莓浆果，固定复合酶添加量（果胶酶添加量为0.15%，纤维素酶添加量为0.08%，半纤维素酶添加量为0.08%）、酶解温度50 ℃，考察不同酶解时间（0.5，1，1.5，2，2.5和3 h）对蓝莓出汁率的影响。以蓝莓出汁率和透光率作为评价指标，每个试验重复3次，确定酶解的最适时间。

1.3.3.7 响应面试验设计

1.3.4 检测方法

1.3.4.1 出汁率测定

酶解后的蓝莓清汁离心取上清液，所得清汁质量占酶解前蓝莓汁质量的百分比为出汁率[11]。

1.3.4.2 花青素含量的测定

参考孙瑞悦等[12]、Liu等[13]的方法并稍作修改。取1 g酸奶块粉末样品于具塞刻度试管中，用提取液（无水乙醇+水+盐酸=2∶1∶1，V/V）定容至50 mL，超声提取30 min，沸水浴水解1 h，冷却，用提取液再次定容至刻度线，静置，取上清液，用0.22 μm水相过滤备用。液相色谱条件[14]：使用色谱柱C18液相色谱柱，流动相为乙腈（溶液A）和1%甲酸水溶液（溶液B），柱温40 ℃，流速1 mL/min，进样量为10 μL，洗脱条件如下表3所示。

表3 梯度洗脱程序

1.3.4.3 蓝莓清汁综合评价指标

蓝莓清汁综合评价指标按式（1）计算。

综合评分=出汁率×50%+花青素含量×50%（1）

1.4 数据处理

采用SPSS和Origin软件进行数据分析，绘制折线图，采用Design-Expert进行试验设计及响应面分析。

2 结果与分析

2.1 果胶酶添加量对酶解效果的影响

由图1可知，在果胶酶添加量0.05%～0.3%范围内，随着果胶酶添加量的增加，蓝莓清汁的出汁率先上升后平缓的趋势。这是由于果胶酶能够降解浆果中果胶物质，从而破坏植物细胞壁，提高果汁出汁率，降低果汁黏度。当果胶酶添加量为0.15%时，出汁率达到最大值（64.2%），当果胶酶继续增加时，出汁率无明显变化，这是因为果浆定量时，其所含果胶物质含量一定，果胶酶过多只能加速酶解反应，不会提高出汁率[15]。此外，蓝莓清汁中花青素含量也呈现出与出汁率相同的趋势，且在0.15%时花青素含量最高。因此果胶酶的最适添加量范围为0.12%～0.17%。

图1 果胶酶添加量对酶解效果的影响

2.2 纤维素酶添加量对酶解效果的影响

由图2可知，在纤维素酶添加量0.02%～0.18%范围内，随着纤维素酶添加量的增加，蓝莓清汁的出汁率先上升后平缓的趋势。这是由于纤维素酶能够破坏植物细胞壁，从而提高果汁出汁率。当纤维素酶添加量为0.1%时，出汁率达到最大值（56.3%），当纤维素酶继续增加时，出汁率无明显增加，这是因为酶过量导致溶液体系黏度增大，限制酶解反应速率[16]。此外，蓝莓清汁中花青素含量与出汁率呈现出相同趋势，且在0.1%时花青素含量最高。因此纤维素酶的最适添加量范围为0.08%～0.12%。

图2 纤维素酶添加量对酶解效果的影响

2.3 半纤维素酶添加量对酶解效果的影响

由图3可知，在半纤维素酶添加量0.02%～0.12%范围内，随着半纤维素酶添加量的增加，蓝莓清汁的出汁率先上升后平缓的趋势，当半纤维素酶添加量为0.08%时，出汁率达到最大值（51.9%），当半纤维素酶继续增加时，出汁率无明显变化。此外，在一定范围内，蓝莓清汁中花青素含量与出汁率呈现出相同趋势，且在0.06%时花青素含量最高。因此纤维素酶的最适添加量范围为0.06%～0.1%。

图3 半纤维素酶添加量对酶解效果的影响

2.4 复合酶配比正交优化试验

由表4可知，各因素水平对蓝莓清汁的综合评分影响顺序为A（果胶酶添加量）＞B（纤维素酶添加量）＞C（半纤维素酶添加量），果胶酶添加量是影响蓝莓清汁综合评分的最主要因素，其次是纤维素酶添加量、半纤维素酶添加量，其最优组合为A2B1C2，即果胶酶添加量为0.15%，纤维素酶添加量为0.08%，半纤维素酶添加量为0.08%。复合酶最优组合综合评价指标为49.48分，故选择复合酶配比（果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶）分别为0.12%∶0.08%∶0.08%，0.15%∶0.08%∶0.08%和0.18%∶0.08%∶0.08%作为响应面试验的3个水平。

表4 复合酶配比正交试验结果

2.5 酶解温度对酶解效果的影响

由图4可知，蓝莓清汁中花青素含量与出汁率均随酶解温度的增加而呈现先上升后下降的趋势，当酶解温度为50 ℃时，出汁率达84.57%，花青素含量为10.3 mg/100 g。这是因为在最适温度下酶活性达到最大值，使果汁中果胶等大分子物质降解，增加出汁率，此外还提高了花青素的溶出率，但温度过高，会导致酶活性丧失，从而失去作用。因此，选择45，50和55 ℃作为响应面的3个水平。

图4 酶解温度对酶解效果的影响

2.6 酶解时间对酶解效果的影响

由图5可知，蓝莓清汁中花青素含量与出汁率均随酶解时间的增加而呈现先上升后平缓的趋势，当酶解温度为3 h时，出汁率达88.05%，花青素含量为13.01 mg/100 g，此后，随着时间的延长，对出汁率及花青素含量影响不大。这是因为适当的酶解时间有利于蓝莓胞内物质溶出，时间过长导致花青素损失率增加。因此，综合考虑选择2，2.5和3 h作为响应面试验的3个水平。

图5 酶解时间对酶解效果的影响

2.7 响应面试验结果分析

2.7.1 回归模型的建立与方程分析

在单因素试验结果的基础上，以酶解时间（A）、酶解温度（B）、复合酶配比（C）作为响应因子，以蓝莓清汁综合评价作为响应值，建立Box-Behnken试验设计模型，对三因素三水平进行响应面分析，优化蓝莓清汁酶解加工工艺。试验设计方案及结果如表5所示。

表5 响应面分析试验设计及结果

利用Box-Behnken响应面对表4试验数据进行多元回归拟合，得到蓝莓清汁综合评价的二元多项回归方程：

模型方程显著性检验如表6所示。回归项中模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明方程与实际情况拟合比较好，能够准确反映综合评分与各因素之间的关系。一次项（A、C）、交互项（BC）、二次项（A2、B2、C2）对蓝莓清汁评分具有极显著影响（P＜0.01）；一次项（B）、交互项（AB、AC）对蓝莓清汁评分影响不显著（P＞0.05）。此外，F值越大，说明该因素对蓝莓清汁综合评分影响越大[17]。因此，比较F值大小可知，各因素影响蓝莓清汁综合评分的大小依次为A（酶解时间）、C（复合酶配比）、B（酶解温度）。

表6 回归方程方差分析

2.7.2 响应面因素交互作用分析

由因素显著项（P＜0.05）交互作用的响应面图（图6）分析可得，综合评分在所选范围内存在极点，响应面坡度陡峭、等高线呈椭圆形，反映出各因素之间的两两交互作用显著[18]。酶解温度和复合酶配比之间的交互作用显著，对结果影响较大，与表6结果一致，进一步直观地说明该试验模型具有较好的可靠性和可行性。

图6 酶解温度和复合酶配比对综合评分影响的响应面图（A）和等高线图（B）

2.7.3 响应面最优条件预测与验证试验

经响应面最优组合分析，确定蓝莓清汁酶解工艺条件：酶解温度49.14 ℃，酶解时间2.42 h，复合酶配比0.15%∶0.08%∶0.08%。在此条件下，蓝莓清汁的最佳综合评分为50.12分。为方便实际的试验操作，将最佳工艺参数修正为酶解温度50 ℃、酶解时间2.5 h、复合酶配比0.15%∶0.08%∶0.08%。采用修正后的工艺参数进行3次平行试验，蓝莓清汁综合评分为50.1±0.3分，与理论预测值非常接近，可知利用响应面分析法优化蓝莓清汁酶解工艺参数具有实际可行性。

3 结论

通过单因素试验、正交试验和Box-Behnken响应面优化了蓝莓清汁饮料的酶解工艺条件。试验结果表明：蓝莓清汁的最佳酶解工艺为酶解温度50 ℃、酶解时间2.5 h、复合酶配比0.15%∶0.08%∶0.08%，在此条件下，蓝莓清汁的综合评分为50.1±0.3分。通过响应面分析和验证试验证明，建立的数学模型合理可靠，可为后期蓝莓清汁饮品开发提供参考。